ΚΥΚΛΙΝΟ-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ Πανεπιστήμιο Αθηνών Φαρμακευτική Σχολή Τομέας Φαρμακογνωσίας και Χημείας Φυσικών Προϊόντων ΙΝΤΙΡΟΥΜΠΙΝΕΣ ΚΥΚΛΙΝΟ-ΕΞΑΡΤΩΜΕΝΕΣ ΚΙΝΑΣΕΣ Προκόπιος Μαγιάτης

ΣΥΛΛΟΓΕΣ Διάφορα μαλάκια συλλέχθηκαν στην Σαλαμίνα το 1998 και 1999 Η Nucella lapillus συλλέχθηκε το 2002 κοντά στο Station Biologique de Roscoff (Βόρεια Γαλλία)

ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ ΕΚΧΥΛIΣΗ Αφαίρεση των κελυφών όπου είναι απαραίτητο Κατάψυξη και λυοφιλοποίηση Εκχύλιση με διχλωρομεθάνιο, Μεθανόλη, νερό

ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑΤΩΝ Κανένα από τα εκχυλίσματα δεν έδειξαν αξιόλογη δράση στις CDK’s ή τη GSK-3. Μόνο το διχλωρομεθανικό εκχύλισμα του Hexaplex trunculus είχε μια μικρή δράση στη GSK-3, ενώ κατά πολύ μικρότερη δράση φανέρωσαν τα αντίστοιχα των Nucella lapillus και Bolinus brandaris. Συνήθως στο σημείο αυτό εγκαταλείπεται η προσπάθεια.

Κλασματοποίηση 5 Kg of του Hexaplex trunculus. Ακολούθησαν 2 διαδοχικοί χρωματογραφικοί διαχωρισμοί (μιας ανοιχτής στήλης υπό κενό και μιας υπό χαμηλή πίεση). Παραλήφθηκαν 4 κλάσματα (1-2 mg το καθένα) που περιείχαν μίγματα των κόκκινων χρωστικών. Προσπαθήσαμε να αξιολογήσουμε φαρμακολογικά τα μίγματα

Μίγματα CDK1 CDK5 GSK3β IC50 (μg/ml) 1. A=B 100 65 2. A<B 3. A<B=C 0.21 4. A,B,C<D 12 3 0.72 A- ---- ---- --- B- --- --- --- Τα κλάσματα 1,2 με τα δύο πρώτα συστατικά (A,B) ήταν τελείως αδρανή. Μόνο τα κλάσματα 3,4 που περιείχαν το συστατικό C ήταν δραστικά στην GSK3 Το κλάσμα 4 που περιείχε το C και το D συστατικό, ήταν δραστικό αλλά όχι εκλεκτικό. Συμπέρασμα: Το τρίτο ίχνος ανταποκρίνεται σε πιθανό εκλεκτικό αναστολέα της GSK-3. C- --- D 1 2 3 4 Μίγματα

Ακολούθησε νέα συλλογή του Hexaplex trunculus 60 Kg. Διχλωρομεθανικό εκχύλισμα: 162 gr Ακολούθησαν 2 διαδοχικοί χρωματογραφικοί διαχωρισμοί υπό κενό. Κατόπιν υγρή χρωματογραφία μέσης πίεσης (MPLC). Απομονώθηκαν 4 συστατικά με έντονο κόκκινο χρώμα. Μελετήθηκαν με NMR και MS. Οδηγηθήκαμε στις ακόλουθες δομές.

6-βρωμοϊντιρουμπίνη Νέο φυσικό προϊόν A B C D 6’-βρωμοϊντιρουμπίνη Νέο φυσικό προϊόν

ΦΑΡΜΑΚΟΛΟΓΙΚΗ ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΚΑΘΑΡΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΠΡΟΪΟΝΤΩΝ Προϊόντα CDK1 CDK5 GSK3β IC50 (μΜ) 6,6’-διβρωμοϊντιρουμπίνη 100 4.500 6’-βρωμοϊντιρουμπίνη 22.000 6-βρωμοϊντιρουμπίνη 90.000 53.000 0.045 ιντιρουμπίνη 10.000 1.000 Chemistry & Biology, 2003, 10, 1255-1266

ΣΥΝΘΕΣΗ ΚΑΙ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ ΦΥΣΙΚΩΝ ΧΡΩΣΤΙΚΩΝ, ΤΩΝ Ν-Me ΑΝΑΛΟΓΩΝ ΤΟΥΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΟΞΙΜΩΝ ΤΟΥΣ. Λόγω της μικρής ποσότητας των φυσικών ιντιρουμπινών προχωρήσαμε στην ολική τους σύνθεση Ταυτόχρονα με τη σύνθεση των φυσικών ιντιρουμπινών πραγματοποιήθηκαν οι συνθέσεις: N-Me αναλόγων Οι οξίμες, ακετοξίμες και μεθοξίμες στη θέση 3’ των παραπάνω μορίων.

ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΔΙΜΕΡΙΣΜΟΥ ΤΩΝ ΙΝΤΙΡΟΥΜΠΙΝΩΝ

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΗΣ 6-ΒΡΩΜΟΪΣΑTΙΝΗΣ

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ ΜΕΘΥΛΙΩΜΕΝΩΝ ΙΣΑΤΙΝΩΝ

Σύνθεση των οξιμών των φυσικών αναλόγων, των N-Me, της 3’-ακετοξίμης, 3’-μεθοξίμης της 6-βρωμοϊντιρουμπίνης

IN VITRO ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΙΣ ΚΙΝΑΣΕΣ

ΒΙΟ

ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΒΙΟ ΚΑΙ ΤΗΣ 3’-ΑΚΕΤΟΞΙΜΗΣ ΤΗΣ 6-ΒΡΩΜΟΪΝΤΙΡΟΥΜΠΙΝΗΣ

ΠΡΟΣΔΕΣΗ ΤΗΣ ΒΙΟ ΣΤΗΝ ATP POCKET ΤΗΣ GSK-3. ΚΡΥΣΤΑΛΛΟΓΡΑΦΙΚΕΣ ΜΕΛΕΤΕΣ Σε συνεργασία Ευρωπαϊκό Ινστιτούτο Ογκολογίας του Μιλάνου (Structural Biology)

GSK-3β LEU 132 ILE 62 ASP 133 TYR 134 VAL 135 LEU 188 6 Bromo indirubin 3’ oxime (BIO) LEU 188 GSK-3β

steric hindrance CDK5

CDK5

ΕΡΜΗΝΕΙΑ ΤΗΣ ΕΚΛΕΚΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΤΗΣ ΒΙΟ ΣΤΗΝ GSK-3 ΕΝΑΝΤΙ ΤΗΣ CDK5

IN VIVO ΠΕΙΡΑΜΑΤΑ ΣΕ ΕΜΒΡΥΑ XENOPUS LAEVIS Μάρτυρας N-Me Bio BIO σε διάφορες συγκεντρώσεις Li+

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ 6 ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΗΣ 6-ΒΙΝΥΛΟΪΝΤΙΡΟΥΜΠΙΝΗΣ

IN VITRO ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΙΣ ΚΙΝΑΣΕΣ ΤΩΝ 6-ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ J. Med. Chem 2004, 47, 935-946.

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΩΝ 5,6 ΔΙΣ-ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ

ΣΥΝΘΕΣΗ ΤΗΣ 5-ΝΙΤΡΟ-6-ΒΡΩΜΟΪΣΑΤΙΝΗΣ

IN VITRO ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΣΤΙΣ ΚΙΝΑΣΕΣ ΤΩΝ 5,6-ΔΙΣ-ΥΠΟΚΑΤΕΣΤΗΜΕΝΩΝ ΑΝΑΛΟΓΩΝ

ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΒΛΑΣΤΟΚΥΤΤΑΡΑ (Nature Medicine 2004, 10, 55-63) ΛΕΙΣΜΑΝΙΑΣΗ (Antimicrob. Agents Chemother. 2004, 48, 3033-3042) IΟΙ (HPV) (Oncogene 2004, 23, 8206-8215) ΝΕΥΡΟΕΚΦΥΛΙΣΤΙΚΕΣ ΝΟΣΟΙ (Am. J. Physiol. Renal. Physiol. 2004 Nov 30) Αυξημένη ζήτηση από πολλα βιολογικά κέντρα παγκοσμίως.

Πιλοτική παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων της BIO

100 gr BIO Τελικό στάδιο παραγωγής