ΑΝΤΙΓΟΝA ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ Aντιγόνα-Ανοσογόνα-Ανοχογόνα 3-4 / 10 & 15-10-2012 Ρ. Τσιτσιλώνη ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝA Aντιγόνα-Ανοσογόνα-Ανοχογόνα Παράγοντες που επηρεάζουν την ανοσογονικότητα ενός μορίου Επίτοποι Απτένια Υπεραντιγόνα

I. Bασικές έννοιες - Ορισμοί Αντιγόνο (Antigen): ουσία που συνδέεται ειδικά με ένα μόριο αντισώματος ή με τον επιφανειακό υποδοχέα των δραστικών Τ λεμφοκυττάρων και μπορεί να αποτελέσει στόχο της ανοσολογικής απάντησης Ανοσογόνο (Immunogen): ουσία που μπορεί να προκαλέσει την παραγωγή αντισωμάτων ή/και δραστικών Τ λεμφοκυττάρων, δηλ. επάγει ανοσολογική απάντηση Ανοχογόνο (Tolerogen): ουσία που δεν μπορεί να ενεργοποιήσει ικανό αριθμό λεμφοκυττάρων και επάγει ανοχή (μη αντιδραστικότητα). Αποτυγχάνει να προκαλέσει ειδική ανοσολογική απάντηση αλλά και αναστέλλει την λεμφοκυτταρική ενεργοποίηση σε μεταγενέστερες χορηγήσεις της ανοσογονικής μορφής της ίδιας ουσίας.

Ανοσολογική απάντηση – ανοχή - άγνοια

Χαρακτηριστικά των αντιγόνων Ι. Ανοσογονικότητα: ικανότητα να επάγουν χυμική ή/και κυτταρική ανοσιακή απάντηση Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο Β-κύτταρο + αντιγόνο εκκρίνει αντισώματα Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης CTL, Th, κλπ Τ-κύτταρο + αντιγόνο εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες ΙΙ. Αντιγονικότητα: ικανότητα να συνδέονται με τα τελικά προϊόντα της ανοσιακής απάντησης

Ανοσογονικότητα των αντιγόνων

II. Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Η διάκριση εαυτού-ξένου (Ι) ανοσολογική ενεργοποίηση Οι φυσιολογικοί εαυτοί ιστοί επάγουν ανοσολογική ανοχή (ανοχογόνα?) Οι μη φυσιολογικοί εαυτοί και οι ξένοι ιστοί επάγουν ανοσολογική ενεργοποίηση

Η διάκριση εαυτού-ξένου (ΙΙ)

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Μοριακά βάρη γνωστών αντιγόνων Αντιγόνο Μοριακό βάρος (σε Da) Γάμμα σφαιρίνη βοός (ΒGG) 150.000 Αλβουμίνη ορού βοός 69.000 Φλαγγελίνη (μονομερές) 40.000 Λυσοζύμη αυγού όρνιθας (HEL) 15.000 Αιμοκυανίνη (KLH) > 2.000.000 Οβαλβουμίνη (OVA) 44.000 Mυοσφαιρίνη σπέρματος φάλαινας (SWM) 17.000 Τοξοειδές τετάνου (TT) 150.000 ΜΒ > 100 kDa: συνήθως ανοσογονικές ουσίες

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Σημασία δομής και ετερογένειας μη ανοσογονικό ανοσογονικό

Σημασία δομής και ετερογένειας πρωτεΐνες και πολυσακχαρίτες λιπίδια και πυρηνικά οξέα συνθετικά πολυπεπτίδια από >2-3 αα ανοσογονικά μόρια μη ανοσογονικά μόρια συνθετικά πολυπεπτίδια από 1 αα πεπτίδια με αρωματικά κατάλοιπα (Tyr)

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Σύνοψη των οδών επεξεργασίας και παρουσίασης αντιγόνου

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Η σημασία δόσης και οδού χορήγησης του Ag (ανοχογόνο)

Τι επηρεάζει την ανοσογονικότητα ενός μορίου Ι. Παράγοντες που αφορούν το αντιγόνο ιδιότητα διάκρισης του μορίου ως ξένου μοριακό μέγεθος χημική δομή και ετερογένεια δυνατότητα διάσπασης του μορίου από τα ένζυμα των APC ΙΙ. Παράγοντες που αφορούν τον οργανισμό γενετικοί παράγοντες δόση του αντιγόνου οδός χορήγησης του αντιγόνου χρήση ανοσολογικών προσθετικών (ανοσοενισχυτικών)

Τρόπος δράσης γνωστών ανοσοενισχυτικών

Η Θεωρία των Πλευρικών Αλυσίδων (παραγωγή και δράση των αντισωμάτων) P. Ehrlich, Proc. R. Soc. London, 66:424, 1900

Η Θεωρία της Κλωνικής Επιλογής

Η συμπληρωματική σχέση αντιγόνου-αντισώματος σχέση «κλειδιού-κλειδαριάς» 15-22 αμινοξέα του Ag συνδέονται με το Ab σύνδεση με δεσμούς Η+, ιονικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις

III. Επίτοποι Περιοχές των αντιγόνων που συνδέονται με διαλυτά αντισώματα ή υποδοχείς Β ή Τ λεμφοκυττάρων Είδη επιτόπων: πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι αλληλοεπικαλυπτόμενοι γραμμικοί ή συνεχείς διαμορφωτικοί κρυπτικοί επίτοποι Β λεμφοκυττάρων επίτοποι Τ λεμφοκυττάρων

Είδη επιτόπων των Β κυττάρων Γραμμικός Διαμορφωτικός

Είδη επιτόπων των Β κυττάρων Γραμμικός Πολλαπλοί, μη επικαλυπτόμενοι Διαμορφωτικός

Η σημασία της τριτοταγούς δομής

Η αναγνώριση του Ag από τα λεμφοκύτταρα Ενεργοποίηση T κυττάρων Δευτερογενής ανοσολογική απάντηση 1η ανοσοποίηση 2η ανοσοποίηση Παραγωγή αντισωμάτων Ενεργοποίηση T κυττάρων Φυσική πρωτεΐνη + Αποδιαταγμένη πρωτεΐνη -

Δημιουργία Τ επιτόπων ενδοκυττάρωση Ag επεξεργασία Αg σύνδεση με MHC μόρια παρουσίαση επιτόπου αναγνώριση από TCR σύνδεση MHC-πεπτίδιο + TCR ενεργοποίηση Τ κυττάρου

Παρουσίαση Τ επιτόπων MHC-περιορισμός (MHC restriction)

Η πρόσδεση και αναγνώριση των Τ επιτόπων πεπτίδια που προσδέ-νονται ισχυρότερα σε MHC μόρια συνήθως ενεργοποιούν αποτελεσματικότερα τα TH κύτταρα

Ιδιότητες Β και Τ επιτόπων Χαρακτηριστικό Β κύτταρα Τ κύτταρα Αλληλεπίδραση με το αντιγόνο Εμπλέκει το διμερές σύμπλεγμα μεμβρανικής Ig και Ag Εμπλέκει το τριμερές σύμπλεγμα υποδοχέα των Τ κυττάρων, Ag και MHC μορίου Δέσμευση διαλυτού αντιγόνου Ναι Όχι Εμπλοκή των MHC μορίων Δεν απαιτείται Απαιτείται για να εκθέσουν το επεξεργασμένο αντιγόνο Χημική φύση των αντιγόνων Πρωτεΐνη, πολυσακχαρίτης, λιπίδιο Κυρίως πρωτεΐνες, αλλά και μερικά λιπίδια και γλυκολιπίδια που παρουσιάζονται από MHC-προσομοιάζοντα μόρια Ιδιότητες των επιτόπων Προσιτός, υδρόφιλος, ευκίνητα πεπτίδια που περιέχουν συνεχή ή ασυνεχή αμινοξέα Εσωτερικά γραμμικά πεπτίδια που δημιουργούνται μετά από επεξεργασία του αντιγόνου και προσδένονται στα MHC μόρια

IV. Επαγωγή ανοσογονικότητας σε απτένια σύνδεση απτενίου (DNP) με πρωτεΐνη-φορέα (BSA)

Παραδείγματα αντιγόνων & απτενίων ΠΛΗΡΗ ΑΝΤΙΓΟΝΑ Ινσουλίνη Γαστρίνη Καλσιτοτίνη Αντιδιουρητική ορμόνη ΑΠΤΕΝΙΑ Πενικιλίνη Ασπιρίνη Σουλφοναμίδη Γενταμυκίνη

V. Υπεραντιγόνα Το υπεραντιγόνο Μονοκλωνική προκαλεί διέγερση Τ πολυκλωνική διέγερση των Τ λεμφοκυττάρων Μονοκλωνική διέγερση Τ λεμφοκυττάρων

ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ Δυναμική αλληλεπιδράσεων αντιγόνου-αντισώματος Αντιδράσεις κατακρήμνισης σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης άμεση έμμεση ή παθητική Ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA Western blotting Ανοσοφθορισμός-κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων Πειραματικά μοντέλα σε ζώα

Ι. Δυναμική αλληλεπιδράσεων k1 Ag + Ab Ag-Ab k2 Συγγένεια (affinity): ένα μόριο Ab με έναν επίτοπο του Ag Δυναμικότητα (avidity): πολλαπλές θέσεις δέσμευσης Ab-Ag

Αλληλεπιδράσεις που συμμετέχουν στην αντίδραση Ag-Ab (75-120)

Τύποι ανοσοαντιδράσεων Αντιδράσεις κατακρήμνισης (ιζηματινοαντιδράσεις) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων

Ευαισθησία διαφόρων ανοσοδοκιμασιών Δοκιμασία Ευαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα 20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony   10-50 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 0.006-0.06 RIA 0.0006-0.006 ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~0.0001-0.01 ~0.00001-0.01 Ανοσοφθορισμός 1 Κυτταρομετρία ροής

VII. Πειραματικά μοντέλα σε ζώα-Ποντίκια SCID γυμνό ή αθυμικό ποντίκι (nu/nu)

Διαγονιδιακά ποντίκια-έκφραση συγκεκριμένου γονιδίου

Κnockout ποντίκια: in vitro προετοιμασία

Κnockout ποντίκια (ομόζυγα)-διαγραφή γονιδίου

Σύγκριση διαγονιδιακών και knockout ποντικών Χαρακτηριστικό Διαγονιδιακό ζώο Knockout ζώο Κύτταρα που εισάγεται το DNA Ζυγωτό Εμβρυϊκά αρχέγονα κύτταρα (stem cells) Κατασκευές DNA Φυσιολογικό γονίδιο ή cDNA Μεταλλαγμένο γονίδιο Τρόπος μεταφοράς Μικροένεση στο ζυγωτό και εμφύτευση στη θετή μητέρα Μεταφορά των αρχέγονων κυττάρων σε βλαστοκύστη και εμφύτευση στη θετή μητέρα Τελικό αποτέλεσμα Εισαγωγή ενός επιπλέον γονιδίου Απώλεια ενός γονιδίου