Mικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR) Άσκηση 13 Mικτή Λεμφοκυτταρική Αντίδραση (Mixed Lymphocyte Reaction; MLR) Ράνια Τσιτσιλώνη Λίλα Φωτεινοπούλου

Μέθοδοι προσδιορισμού HLA αντιγόνων Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR)

Μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία

Μοριακή τυποποίηση με χρήση PCR PCR-SSP PCR-SSO

Tα επίπεδα της HLA τυποποίησης Χαμηλής ακρίβειας: σε επίπεδο ορολογικής ειδικότητας (πιο αλληλόμορφο εκφράζεται) Ενδιάμεσης ακρίβειας: σε επίπεδο ομάδας αλληλομόρφων Υψηλής ακρίβειας: σε επίπεδο αλληλομόρφου (νουκλεοτιδική αλληλουχία) DRB1*0401 HLA αλληλόμορφο γονιδιακά τυποποιημένο HLA μόριο HLA αντιγόνο ορολογικά τυποποιημένο

Οι υπο-ομάδες των αλληλομόρφων DR3 DR17 DRB1*0301 DRB1*0302 DR18 DRB1*0303 Ειδικότητες HLΑ: Παράρτημα στο βιβλίο σας

Η αρχή της MLR

Τι είναι η MLR Τι μας δείχνει η MLR In vitro μέθοδος με την οποία εξετάζουμε τη λειτουργική κατάσταση του ανοσοποιητικού συστήματος ελέγχοντας τη δυνατότητά του να απαντά σε αυτόλογα ή ετερόλογα αντιγόνα Μέθοδος ποσοτικοποίησης της συμβατότητας HLA τάξης ΙΙ Τι μας δείχνει η MLR την ικανότητα ενεργοποίησης των Τ κυττάρων και των μονοκυττάρων την ικανότητα δημιουργίας Τc και Ts λεμφοκυττάρων την ικανότητα ρύθμισης ανοσολογικών λειτουργιών (πχ. παραγωγή Ab) την ικανότητα απάντησης των Τ λεμφοκυττάρων σε μιτογόνα ή αλλοαντιγόνα την ικανότητα παραγωγής σημαντικών κυτταροκινών (πχ IL-2, IL-1, IFNs, TNFs)

Διαφορά με την in vivo κατάσταση Τύποι MLR Μονόδρομη Αμφίδρομη Αυτόλογη Ετερόλογη Διαφορά με την in vivo κατάσταση μεταβάλλουμε την αριθμητική σχέση των κυττάρων μεταξύ τους (Τ λεμφοκύτταρα : μονοκύτταρα = 1:1)

Μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση

Δ. Πειραματική διαδικασία Βάζουμε από 2 ml εναιώρημα σπληνοκυττάρων Balb/c και 2 ml C57BL/6 στα πλαστικά σωληνάρια (από το R1΄ στο S1 και από το R2΄ στο S2) Προσθέτουμε 50 μl μιτομυκίνης C, επωάσουμε για 45 min σε κλίβανο 37οC με ανακίνηση ανά 15 min. Γεμίζουμε τα σωληνάρια με PBS Φυγοκέντρηση : 1200 rpm για 5 min (2 φορές) Επαναιωρούμε σε 1,5 ml θρεπτικού υλικού Μετράμε τα κύτταρα-απαντητές (R1) (50 μl κύτταρα + 50 μl Trypan blue στο γυάλινο σωληνάκι) στη Neubauer. Αραιώνουμε με θρεπτικό υλικό ώστε η συγκέντρωση να είναι 2 x 106 κύτταρα/ml. Σε πλάκα 96 φρεατίων τοποθετούμε: 100 μl από τα κύτταρα-απαντητές (R1) σύμφωνα με τον πίνακα 13.1 100, 50 ή 25 μl από τα κύτταρα-διεγέρτες (S1 και S2) συμπληρώνουμε με θρεπτικό υλικό μέχρι τελικού όγκου 200 μl/φρεάτιο ΠΡΟΣΟΧΗ: βάζουμε πάντα θετικούς (σειρά Β) και αρνητικούς (σειρά Α) μάρτυρες Βάζουμε την πλάκα για επώαση σε κλίβανο 37οC, 5% CO2 για 5 ημέρες

Μέτρηση μονοπύρηνων αίματος Ανάμειξη PBMC με Trypan blue

Αιμοκυτταρομέτρο (πλάκα Neubauer) (1/5x1/5x1/10) 1x1x1/10

Πίνακας 13.1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H R1 100 μl S1 100 μl S2 100 μl + IL-2 S1 25 μl S1 50 μl S2 25 μl S2 50 μl

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί Για το φυλλάδιό σας Υπολογίζουμε μέσο όρο cpm θετικών και αρνητικών μαρτύρων και των υπό εξέταση δειγμάτων (αφαιρούμε από όλα τους αντίστοιχους αρνητικούς μάρτυρες) Γραφική παράσταση αναλογίας κυττάρων-απαντητών προς διεγέρτες συναρτήσει των cpm για τις ομάδες R1-S1 (αυτόλογη MLR) και R1-S2 (ετερόλογη MLR) Πού παρατηρείτε μεγαλύτερη ικανότητα πολλαπλασιασμού και γιατί; Τι παρατηρείται στα φρεάτια όταν προσθέσατε IL-2;