ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN

Slides:



Advertisements
Παρόμοιες παρουσιάσεις
ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΕΚΧΥΛΙΣΗ
Advertisements

Ιονική ισχύς Η ιονική ισχύς, Ι, ενός διαλύματος δίνεται σαν το ημιάθροισμα του γινομένου της συγκέντρωσης καθενός συστατικού του διαλύματος πολλαπλασιασμένης.
Μέθοδοι μέτρησης κυτταροτοξικότητας
ΕΜΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ-ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΟ ΕΤΟΣ ΒΙΟΛΟΓΙΚΗ-ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΠΑΡΟΥΣΙΑΣΗ Protein Determination by the BCA method Protein Determination.
ΕΘΝΙΚΟ ΜΕΤΣΟΒΙΟ ΠΟΛΥΤΕΧΝΕΙΟ ΣΧΟΛΗ ΜΗΧΑΝΟΛΟΓΩΝ ΜΗΧΑΝΙΚΩΝ ΕΜΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗ & ΒΙΟΙΑΤΡΙΚΗ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ 9ο ΕΞΑΜΗΝΟ ‘Measuring protein concentration with the.
IrYdium Chemistry Lab.
ΤΜΗΜΑ ΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΤΡΟΦΙΜΩΝ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΒΙΟΜΗΧΑΝΙΚΗΣ ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑΣ
ΑΥΞΟΡΡΥΘΜΙΣΗ ΤΟΥ microRNA-34a ΚΑΤΑ ΤΗ ΔΙΑΡΚΕΙΑ ΤΩΝ ΕΠΙΛΗΠΤΙΚΩΝ ΚΡΙΣΕΩΝ ΠΟΥ ΠΡΟΚΑΛΟΥΝ ΤΟ ΘΑΝΑΤΟ ΝΕΥΡΩΝΩΝ.
Χρώση Μπλέ του μεθυλενίου- Κινητική
Ανοσολογία Ενότητα 12: Aιμολυτικό συμπλήρωμα Πέτρος Καρκαλούσος Τμήμα Ιατρικών Εργαστηρίων Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Αθήνας Το περιεχόμενο του.
Μελέτη των λειτουργιών του πεπτικού συστήματος
ΧΗΜΕΙΑ Γ’ ΛΥΚΕΙΟΥ ΚΕΦ.2.Θ: ΟΓΚΟΜΕΤΡΗΣΗ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗΣ (α) ΕΡΩΤΗΣΕΙΣ ΚΑΤΑΝΟΗΣΗΣ Τι είναι: ΟΓΚΟΜΕΤΡΗΣΗ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΗΣ είναι η διαδικασία προσδιορισμού του.
Απομόνωση DNA Mια πλήρης σειρά όλης της γενετικής πληροφορίας ενός ιού ή ενός κυττάρου αποτελεί το γονιδίωμα. Στα σωματικά κύτταρα ενός ευκαρυωτικού οργανισμού.
5. ΟΓΚΟΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΕΞΟΥΔΕΤΕΡΩΣΕΩΣ -πρόκειται για τη σπουδαιότερη τάξη των ογκομετρικών μεθόδων αναλύσεως με ευρύτατη χρήση στη χημεία, τη βιολογία, τη γεωλογία,
1 Άλλες τεχνικές διαχωρισμού, ανίχνευσης και ταυτοποίησης.
Tι είναι οι Πρωτεϊνες Οι πρωτεΐνες αποτελούν τα πιο διαδεδομένα και πολυδιάστατα τόσο στη μορφή όσο και στη λειτουργία τους μακρομόρια. Είναι μεγάλα σύνθετα.
Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης για το πρόγραμμα ΕΣΠΑ 2014 Εργαστήριο Μοριακής Βιολογίας Γελαδάρης Ιωάννης ΑΜ.: Υπεύθυνος Εργαστηρίου: Πολυδεύκης Χατζόπουλος.
Παρουσίαση Πρακτικής Άσκησης για το πρόγραμμα του ΕΣΠΑ Εργαστήριο: Μοριακής Βιολογίας Υπέυθυνος: Ρήγας Σταμάτης Ασκούμενοι: Πατριανάκος Στέφανος, AM:
8. ΣΥΜΠΛΟΚΟΜΕΤΡΙΚΕΣ ΟΓΚΟΜΕΤΡΗΣΕΙΣ Οι συμλοκομετρικές ογκομετρήσεις βασίζονται στο σχηματισμό συμπλόκων ενώσεων, με ελάχιστες εφαρμογές μέχρι το 1945, που.
1 Βιοχημεία - Αρχές Βιοτεχνολογίας - Προσδιορισμός συγκέντρωσης πρωτεϊνών, Τμήμα Τεχνολόγων γεωπόνων, ΤΕΙ ΗΠΕΙΡΟΥ - Ανοιχτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ.
Ογκομετρική ανάλυση Είναι η μεθοδολογία κατά την οποία προσδιορίζεται η συγκέντρωση διαλύματος άγνωστης ουσίας με την προσθήκη μετρήσιμου όγκου διαλύματος.
Υβριδοποίηση νουκλεϊνικών οξέων- Ανίχνευση αλληλουχιών Όταν ένα υδατικό διάλυμα DNA θερμανθεί στους 100 ο C ή εκτεθεί σε πολύ αλακαλικό pH, σπάζουν οι.
ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΑΠΡΙΛΙΟΣ-ΜΑΙΟΣ 2012 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ.
Μελέτη Πρωτεινών Τρούγκος Κ. Αν. Καθ. Βιοχημείας Εργ. Βιολογικής Χημείας Ιατρικής ΕΚΠΑ.
Ιδιότητες των πρωτείνων Η ΥΔΡΟΛΥΣΗ Πρωτείνη ΠΡΩΤΕΟΛΥΤΙΚΑ ΕΝΖΥΜΑ Πεπτίδια, Αμινοξέα Ή ΟΞΕΑ ( HCl ) Η ΜΕΤΟΥΣΙΩΣΗ : καταστροφή της τρισδιάστατης δομής της.
ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN. Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση.
ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN. Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση.
Στοιχεία από τη θεωρία απαραίτητα για την επίλυση ασκήσεων
Διαδικασία ηλεκτροφόρησης DNA
Διαδικασία απομόνωσης γενωμικού DNA από βιολογικό υλικό
Aπομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα παρειάς
ΚΕΦ.2.3: ΙΟΝΤΙΣΜΟΣ ΝΕΡΟΥ, pH (α)
Άσκηση 4 Πηγή ενέργειας για τη μυϊκή σύσπαση.
ΟΙΝΟΛΟΓΙΑ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ 3ο.
ΣΠΟΡΙΟΚΤΟΝΟΣ ΔΡΑΣΗ ΤΗΣ ΚΑΡΒΑΚΡΟΛΗΣ Καρίνου Ε. και Σιβροπούλου Α.
Μελέτη του πεπτικού συστήματος
ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ
Απομόνωση και ταυτοποίηση
Πρωτεομική: Ολιστική ανάλυση πρωτεϊνών των οποίων τα ολικά επίπεδα και οι μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις που φέρουν μεταβάλλονται.
Επίδραση ορμονών στο γλυκογόνο του ήπατος και τη γλυκόζη του αίματος
Λ. Λατανιώτης, Αγγελή I.K., Γαϊτανάκη Αικ. και Μπέης Ι.
Μελέτη των λειτουργιών του πεπτικού συστήματος
Μελέτη των λειτουργιών του πεπτικού συστήματος
Επίδραση της στέρησης τροφής στο μεταβολισμό του ήπατος
Απομόνωση και ταυτοποίηση
Συγκριτική Φυσιολογία Ζώων
ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN
Απομόνωση και ταυτοποίηση A. Φωτεινοπούλου, Α. Μαρμάρη
ΑΛΛΗΛΕΠΙΔΡΑΣΕΙΣ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ
ΧΗΜΕΙΑ Β ΛΥΚΕΙΟΥ ΓΕΝΙΚΗΣ ΠΑΙΔΕΙΑΣ.
Αγγελική Φωτεινοπούλου
Αιμοδοσία (E) Ενότητα 11: Έκλουση αντισωμάτων από RBCs
ΑΣΚΗΣΗ 9 ΑΙΜΟΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗ Πατήστε Esc να κλείσει η προβολή.
Απομόνωση και ταυτοποίηση Ρ. Τσιτσιλώνη, Π. Παπαζαφείρη
«ΑΝΑΠΤΥΞΗ PDLF ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΣΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟΥ ΤΥΠΟΥ ΙΚΡΙΩΜΑΤΑ»
Άσκηση 4 Πηγή ενέργειας για τη μυϊκή σύσπαση.
Απομόνωση και ταυτοποίηση Ανοσοσφαιρινών
Αντιδράσεις κατακρήμνισης Ανοσοδιάχυση (άσκηση 5) Ag: ορός ανθρώπου
Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων
Aσκηση 2 Απομόνωση DNA.
Κούρτη Μαρία Βιολόγος, Msc, PhD 17 Μαρτίου 2017
ΑΝΟΣΟΙΣΤΟΧΗΜΕΙΑ.
Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας
Πειράματα Χημείας για το Γυμνάσιο Σχολ. έτος
Απομόνωση και ταυτοποίηση Ανοσοσφαιρινών
Π.Παπαζαφείρη , Α. Φωτεινοπούλου
ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΝΟΥΚΛΕΪΚΩΝ ΟΞΕΩΝ
Άσκηση 4 Πηγή ενέργειας για τη μυϊκή σύσπαση.
Επίδραση ορμονών στο γλυκογόνο του ήπατος και τη γλυκόζη του αίματος
ΑΝΟΣΟΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ Η ανοσοχρωματογραφία είναι ένας συνδυασμός χρωματογραφίας και ανοσολογικής δοκιμασίας. Είναι μια απο τις πιο σημαντικές και αποτελεσματικές.
Μεταγράφημα παρουσίασης:

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ & ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN

Προετοιμασία δειγμάτων από Abnova Western Blot

Προετοιμασία του Πρωτεϊνικού Δείγματος Για να αναλυθούν οι πρωτεΐνες με ανοσοστύπωμα κατά Western ή ανοσοκατακρήμνιση θα πρέπει να εκχυλιστούν από κύτταρα ή ιστό αλλά και να διατηρηθούν σε διάλυμα. Αυτό επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας απορρυπαντικά όπως Triton X-100, NP-40, SDS κ.λ.π. συνήθως σε περιεκτικότητα 1% στο κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα που μπορεί να περιλαμβάνει 150 mM NaCl, 25 mM Tris-HCI, 2 mM EDTA και αναστολείς πρωτεασών. Ιδιαίτερα στην περίπτωση της ανοσοκατακρήμνισης, η επιλογή του απορρυπαντικού είναι πολύ σημαντική αφού οι συνθήκες πρέπει να είναι τέτοιες ώστε να επιτρέπουν τη δέσμευση του αντισώματος στο αντιγόνο και όταν μελετούνται πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις το απορρυπαντικό θα πρέπει να τις διατηρεί.

ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΝΤOΠΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ  ΕΠΙΛΟΓΗ ΔΙΑΛΥΜΑΤΟΣ ΟΜΟΓΕΝΟΠΟΙΗΣΗΣ ΟΛΙΚΟ ΕΚΧΥΛΙΣΜΑ NP-40 or RIPA ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ (διαλυτή)Tris-HCl ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑ (κυτ/σκελετος)Tris-Triton ΜΕΜΒΡΑΝΟΣΥΝΔΕΟΜΕΝΗ NP-40 or RIPA ΠΥΡΗΝΙΚΗRIPA / ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ * ΜΙΤΟΧΟΝΔΡΙΑΚΟ ΚΛΑΣΜΑ  RIPA / ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ΕΠΙΤΥΓΧΑΝΕΤΑΙ ΕΜΠΛΟΥΤΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΜΕ ΚΛΑΣΜΑΤΩΣΗ ~ ΑΝ ΥΠΑΡΧΕΙ ΥΠΟΚΥΤΤΑΡΙΚΟΣ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ !!! ΧΑΜΗΛΑ ΕΠΙΠΕΔΑ ΕΚΦΡΑΣΗΣ π.χ. πυρηνική πρωτεϊνη Nonidet-P40 (NP40) διάλυμα: κυτ/κες, μεμβρ/νες, ολική εκχύλιση ΜΗ ΔΙΑΛΥΤΗ-ΣΥΣΣΩΜΑΤΩΜΑΤΑ  ΔΙΑΛΥΜΑ RIPA [ιονικά απορρυπαντικά]  διαλυτοποίηση πρωτεϊνών

RIPA buffer (Radio Immuno Precipitation Assay buffer) 50 mM Tris/HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 0.1% SDS  ολικό κυτταρικό εκχύλισμα, μεμβρανοσυνδεόμενες πρωτεϊνες κ πυρηνικό κλάσμα (vs διαλύματα NP- 40 / Triton X100) Προκειμένου να διαφυλαχθούν αλληλεπιδράσεις πρωτεϊνών ή να ελαχιστοποιηθεί η πιθανότητα μετουσίωσής τους (διαφύλαξη επιτόπου που αναγνωρίζει συγκεκριμένο αντίσωμα) απαιτείται χρήση διαλύματος ομογενοποίησης που δε θα περιέχει ιονικά απορρυπαντικά (π.χ. SDS) ούτε και μη-ιονικά (π.χ. Triton X-100). Στην περίπτωση αυτή η κυτταρική λύση επιτυγχάνεται με μηχανικό τρόπο (ομογ/της Dounce homogenizer ή βελόνα)  απλό διάλυμα Tris.

Παράλληλα με τη λύση λαμβάνουν χώρα πρωτεόλυση, αποφωσφορυλίωση και μετουσίωση . Ελαχιστοποιούνται με φύλαξη των δειγμάτων στους 4°C και χρήση κατάλληλων αναστολέων (cocktail αναστολέων εμπορίου). ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ  ειδικός για πρωτεάση / φωσφατάση Aprotinin  Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin Leupeptin Lysosomal Pepstatin A Aspartic proteases PMSF Serine, Cysteine proteases EDTAMetalloproteases [Mg++ and Mn++] EGTA Metalloproteases [Ca++] NaF  Serine/Threonine phosphatases Na OrthovanadateTyrosine phosphatases

ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΗΣ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗΣ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ Bradford assay, Lowry assay ή BCA assay. Bovine serum albumin (BSA)  protein standard. ΦΥΛΑΞΗ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ -20°C ή -80°C. ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΑ ΑΝΑΓΝΩΡΙΖΟΥΝ ΕΠΙΤΟΠΟ [ ΚΑΛΥΨΗ ΛΟΓΩ ΣΤΕΡΕΟΔΙΑΤΑΞΗΣ ]  ΠΡΟΚΕΙΜΕΝΟΥ ΝΑ ΓΙΝΕΙ Η ΑΝΑΓΝΩΡΙΣΗ-ΣΥΝΔΕΣΗ ΠΡΕΠΕΙ ΝΑ «ΞΕΔΙΠΛΩΘΕΙ» Η ΠΡΩΤΕΪΝΗ. ΜΕΤΟΥΣΙΩΣΗ – ΔΙΑΛΥΜΑ ΦΟΡΤΩΣΗΣ (loading buffer) ΜΕ ΑΝΙΟΝΙΚΟ ΑΠΟΡΡΥΠΑΝΤΙΚΟ [ sodium dodecyl sulfate (SDS) ] ΚΑΙ ΒΡΑΣΜΟ 95-100°C 3 min. Standard loading buffer 2X Laemmli buffer {Nature, 1970 Aug 15; 227 (5259): 680-5}. Laemmli 2X buffer: 4%(w/v) SDS, 10%(v/v) 2-mercaptoehtanol, 20%(v/v) glycerol, 0.004%(w/v) bromophenol blue, 0.125 M Tris/HCl pH 6.8 MH MEΤΟΥΣΙΩΤΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ : ΠΑΡΑΛΕΙΠΕΤΑΙ SDS ΚΑΙ Ο ΒΡΑΣΜΟΣ ! ΠΑΡΑΛΕΙΠΟΝΤΑΙ ΕΠΙΣΗΣ ΑΝΑΓΩΓΙΚΟΙ ΠΑΡΑΓΟΝΤΕΣ (ΟΞΕΙΔΩΜΕΝΗ ΜΟΡΦΗ – ΚΑΤΑΛΟΙΠΑ ΚΥΣΤΕΪΝΗΣ) π.χ. ß-mercaptoethanol και DTT (μη αναγωγικές συνθήκες).

ΑΝΟΣΟΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΙΑΣ ΠΡΩΤΕΪΝΗΣ Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή ιστού σε διάλυμα με κατάλληλο απορρυπαντικό Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4οC με αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη για 2-16 ώρες. Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύουν το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

ΠΡΟΕΤΟΙΜΑΣΙΑ ΤΟΥ ΔΕΙΓΜΑΤΟΣ ΓΙΑ ΑΝΑΛΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ Τα σύμπλοκα αντιγόνου-αντισώματος-σφαιριδίων κατακρημνίζονται με φυγοκέντρηση και διαλυτοποιούνται σε διάλυμα που περιέχει (σε τελικές συγκεντρώσεις) Α. 3%(w/v) SDS που αποδιατάσσει τις πρωτεΐνες και τους προσδίδει αρνητικό φορτίο Β. 10 mM EDTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Γ. 10 mM EGTA για να ανασταλούν οι πρωτεάσες Δ. 50%(v/v) γλυκερόλη που βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης Ε. Χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε που βοηθά στο φόρτωμα του πρωτεϊνικού δείγματος στο πηγάδι του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης (παρακολούθηση μετώπου)

ΑΝΙΧΝΕΥΣΗ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ Στη συνέχεια, κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα φρεάτια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης (Bradford). Αντίσωμα Αντιγόνο Ακολουθεί ανίχνευση του αντιγόνου με αυτοραδιογραφία ή ανοσοστύπωμα κατά Western.

ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η’ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Εκχύλιση των πρωτεϊνών κυττάρων ή ιστού σε διάλυμα που περιέχει κατάλληλο απορρυπαντικό Εκχυλίσματα πρωτεϊνών επωάζονται στους 4οC με αντίσωμα ενάντια σε συγκεκριμένη πρωτεΐνη [Α] για 2-16 ώρες. Προστίθενται σφαιρίδια αγαρόζης καλυμμένα με πρωτεΐνη Α ή G που δεσμεύουν το αντίσωμα με μεγάλη συγγένεια.

ΣΥΓΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΔΥΟ Η’ ΠΕΡΙΣΣΟΤΕΡΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Στη συνέχεια, κατάλληλος όγκος δειγμάτων φορτώνεται στα φρεάτια του πηκτώματος της πολυακρυλαμίδης. Αντίσωμα Αντιγόνο 5. Ανίχνευση του αντιγόνου [Β] με αυτοραδιογραφία ή ανοσοστύπωμα κατά Western.

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης: 3-5% (w/v) ακρυλαμίδη, pH 6.8. Επιτρέπει τη συγκέντρωση όλων των πρωτεϊνών σε μια γραμμή/ζώνη εκκίνησης στο πάνω μέρος του πηκτώματος διαχωρισμού. Πήκτωμα διαχωρισμού: >6% ακρυλαμίδη, pH 8.8. Επιτρέπει το διαχωρισμό των πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους.

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Η ηλεκτροφορητική κινητικότητα των πρωτεϊνών είναι αντιστρόφως ανάλογη του ΜΒ τους. Χρώση με Coomassie brilliant blue Δείγματα Πρωτεϊνικοί δείκτες

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN ΗΜΙ-ΣΤΕΓΝΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΑΠΟ ΤΟ ΠΗΚΤΩΜΑ ΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΣΤΟ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ Κατεύθυνση μεταφοράς - κάθοδος Φύλλα Whatman Πήκτωμα ακρυλαμίδης Νιτροκυτταρίνη Φύλλα Whatman + άνοδος

ΠΗΚΤΩΜΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΧΡΩΣΜΕΝΟ ΜΕ COOMASIE BRILLIANT BLUE ΠΡΙΝ ΚΑΙ ΜΕΤΑ ΤΗ ΜΕΤΑΦΟΡΑ ΣΕ ΦΙΛΤΡΟ ΝΙΤΡΟΚΥΤΤΑΡΙΝΗΣ

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Μεταφορά των πρωτεϊνών από το πήκτωμα ακρυλαμίδης σε φίλτρο νιτροκυτταρίνης H Χρώση με Ponceau S επαληθεύει ότι οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν από το πήκτωμα ακρυλαμίδης στο φίλτρο νιτροκυτταρίνης

ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ ΚΑΤΑ WESTERN Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Ανίχνευση της πρωτεΐνης Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H2O2 + DAB +

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ a b Rf = a / b Rf : Είναι ο λόγος της απόστασης που έχει διατρέξει μια πρωτεΐνη μέσα στο πήκτωμα της πολυακρυλαμίδης προς την απόσταση που έχει διατρέξει η χρωστική της βρωμοφαινόλης μπλε (μέτωπο).

ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΣ ΤΗΣ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΜΑΖΑΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ Για κάθε πρωτεϊνικό δείκτη υπολογίζουμε την τιμή Rf και το λογάριθμο της μοριακής του μάζας. Στη συνέχεια, κατασκευάζουμε αντίστοιχη πρότυπη καμπύλη και προσδιορίζουμε μέσω της τιμής Rf της ζητούμενης πρωτεΐνης και τη Μοριακή της Μάζα. logMΜ Rf

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5 λεπτά το κάθε πλύσιμο) με 20 ml TBS-T Η μεμβράνη επωάζεται για 60 λεπτά ή Ο/Ν με αντίσωμα ενάντια στη προς μελέτη πρωτεΐνη σε θερμοκρασία δωματίου ή 4oC. 3. Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5 λεπτά) με 20 ml TBS-Tween 0.05% (v/v) Η μεμβράνη επωάζεται για 45-60 λεπτά με το δεύτερο αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση σε θερμοκρασία δωματίου 5. Η μεμβράνη πλένεται (3 Χ 5) με 20 ml TBS-T Στη μεμβράνη προστίθενται 10 ml υποστρώματος της υπεροξειδάσης για ένα λεπτό Το φως που εκπέμπεται καταγράφεται είτε με ειδική κάμερα είτε με X-Ray film [ECL-enhanced chemiluminescence].

ΑΞΙΟΛΟΓΗΣΗ ΤΩΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΩΝ Υπολογίστε τη μοριακή μάζα της πρωτεΐνης που ανιχνεύσατε με την τεχνική του ανοσοστυπώματος κατά Western Παρουσιάστε τα πλεονεκτήματα και τα μειονεκτήματα της μεθόδου του ανοσοστυπώματος κατά Western σε σχέση με άλλες ανοσολογικές τεχνικές που έχετε ήδη χρησιμοποιήσει Να αναφέρετε παραδείγματα περιπτώσεων όπου μπορεί να εφαρμοστούν οι τεχνικές του ανοσοστυπώματος κατά Western και της ανοσοκατακρήμνισης