ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ ΜΕΓΕΘΩΝ Σχηματική αναπαράσταση της συσκευής SEC Αραιό διάλυμα πολυμερούς ενίεται σε ποσότητα διαλύτη σταθερής ροής, η οποία εξασφαλίζεται από κατάλληλη αντλία. Το πολυμερές παρασύρεται από το διαλύτη στις στήλες του οργάνου, όπου πραγματοποιείται η διαδικασία διαχωρισμού. Οι στήλες περιέχουν τη στατική φάση, δηλαδή κόκκους από πορώδες υλικό. Τα μικρά μόρια περνούν τόσο μεταξύ των κόκκων, όσο εισχωρούν μέσα στους πόρους των κόκκων με αποτέλεσμα να καθυστερεί η έκλουση τους από τη στήλη. Αντίθετα τα μεγάλα σωματίδια με διαστάσεις μεγαλύτερες από το μέγεθος των πόρων δε μπορούν να διέλθουν μέσα απ’ αυτούς με συνέπεια να κινούνται μόνο μεταξύ των κόκκων και να εκλούονται πρώτα. Ο συνολικός όγκος που περιέχεται σε ένα σύστημα SEC, από την αρχή, είναι το άθροισμα του κενού όγκου, V0 (όγκος που βρίσκεται ανάμεσα στους κόκκους) και του εσωτερικού όγκου, Vi (όγκος που καταλαμβάνουν οι πόροι). Ο όγκος του διαλύτη που χρειάζεται για την έκλουση ενός πολυμερούς χαρακτηρίζεται ως όγκος έκλουσης, Ve (elution ή retention volume) και δίνεται από την εξίσωση: Ve = V0 + KVi, K=κλάσμα εσωτερικού όγκου πόρων που καταλαμβάνονται από το πολυμερές. Κ=1, μικρά και Κ=0 μεγάλα μόρια.

Η Κ λέγεται και σταθερά κατανομής ενός συστατικού μεταξύ της κινητής και της στατικής φάσης. Έτσι αν ci η συγκέντρωση ενός συστατικού στο εσωτερικό των πόρων και c0 στον κενό χώρο μεταξύ των κόκκων τότε θα ισχύει: Κ = ci/c0, εξαρτάται από τα γεωμετρικά χαρακτηριστικά των πόρων και των διαλυμένων συστατικών. Έστω ότι τα διαλυμένα μόρια είναι σφαιρικά με ακτίνα R και οι πόροι του υλικού της στήλης είναι κυλινδρικοί με ακτίνα α και μήκος l. Φαινόμενα αποκλειόμενου όγκου παρεμποδίζουν το κέντρο μάζας των σφαιρικών διαλυμένων σωματιδίων να πλησιάζουν το τοίχωμα του κυλινδρικού πόρου σε απόσταση μικρότερη του R. Έτσι τα κέντρα βάρους των διαλυμένων σωματιδίων καταλαμβάνουν τον όγκο ενός μικρότερου κυλίνδρου, ακτίνας α-R. Ο αποκλεισμός μέρος του όγκου του πόρου ευθύνεται για την διαφορετική συγκέντρωση εντός και εκτός πόρου. Ισχύει λοιπόν ότι: K = π(α-R)2l/πα2l = (α-R)2/α2 Τα μακρομόρια μπορούν να θεωρηθούν ότι αποτελούνται από μικρές σφαίρες συνδεόμενες μεταξύ τους, όπως οι χάντρες στο κομπολόι. Στο σχήμα δίνονται δύο διαμορφώσεις ενός μακρομορίου. Αυτές είναι πιθανές σε διάλυμα, αλλά μόνο αυτή που παριστάνεται με τη συμπαγή γραμμή είναι εφικτή εντός του πόρου (συμβολίζεται με κλειστό κύκλο).

Καμπύλη βαθμονόμησης – Προσδιορισμός Mn, Mw και Ι Η SEC δεν είναι απόλυτη μέθοδος, εξαιτίας της σύνδεσης μεταξύ μεγέθους και μοριακού βάρους μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό των μέσων ΜΒ των πολυμερών. Η σχέση μεταξύ logM και Ve είναι γραμμική. Έτσι χρησιμοποιώντας δείγματα γνωστού μοριακού βάρους και μετρώντας τον όγκο έκλουσής τους μπορεί να κατασκευαστεί η καμπύλη αναφοράς. Ο όγκος έκλουσης όμως δεν εξαρτάται άμεσα από το μοριακό βάρος, αλλά από το μέγεθος των μακρομορίων, άρα τα δείγματα που χρησιμοποιούνται για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς και τα αγνώστου μοριακού βάρους δείγματα πρέπει να έχουν την ίδια χημική σύσταση και την ίδια αρχιτεκτονική και οι μετρήσεις των όγκων έκλουσης σε όλα τα δείγματα να γίνονται υπό τις ίδιες ακριβώς πειραματικές συνθήκες (ροή διαλύτη, θερμοκρασία κλπ). Το χρωματογράφημα χωρίζεται σε Ν στοιχειώδη τμήματα. Κάθε τέτοιο τμήμα i είναι τόσο στενό, ώστε να χαρακτηρίζεται από ένα ορισμένο όγκο έκλουσης, Ve,i και ύψος hi Πρέπει να τονιστεί ότι το σήμα που παρέχει ο ανιχνευτής είναι ανάλογο του βάρους του εκλουόμενου συστατικού. Έτσι : hi = wi = NiMi Μi το μοριακό βάρος του συστατικού i. Με βάση την καμπύλη αναφοράς μπορεί να γίνει αντιστοιχία σε κάθε Ve,i ενός Μi. Αποκλειόμενος όγκος σωματιδίου είναι ο όγκος στον οποίο δεν μπορεί να εισέλθει το κέντρο βάρους 2ου σωματιδίου.

Τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για την κατασκευή της καμπύλης αναφοράς και τα προς ανάλυση πολυμερή έχουν ίδια σύσταση και δομή. Η καμπύλη αναφοράς πρέπει να κατασκευάζεται από πρότυπα πολυμερή, δηλαδή από δείγματα με μικρή κατανομή μοριακών βαρών. Κάτι τέτοιο όμως είναι εξαιρετικά δύσκολο να συμβεί για κάθε είδους πολυμερές. Για το λόγο αυτό εμφανίζεται έντονη η ανάγκη χρήσης μίας παγκόσμιας καμπύλης αναφοράς, η οποία θα ισχύει για όλα τα είδη πολυμερών, ανεξάρτητα χημικής δομής και αρχιτεκτονικής. Αυτό είναι εφικτό αν γίνει γραφική παράσταση του μεγέθους των μακρομορίων ως προς τον όγκο έκλουσης. Το μέγεθος των μακρομορίων σε διάλυμα μπορεί να περιγραφεί από τον υδροδυναμικό όγκο, Vh, που είναι ο όγκος σφαίρας στην οποία θεωρητικά μπορεί να εγκλειστεί το πολυμερές. Σύμφωνα με τον Einstein ο υδροδυναμικός όγκος σχετίζεται με το εσωτερικό ιξώδες και το μοριακό βάρος ενός μακρομορίου με τη σχέση: [η]Μ = 0.025ΝΑ Vh (8) Έτσι το γινόμενο [η]Μ είναι μέτρο του υδροδυναμικού όγκου και η γραφική παράσταση ln([η]Μ) = f (Ve) είναι γραμμική και ανεξάρτητη της χημικής δομής ή αρχιτεκτονικής των πολυμερών.

Σχηματικό διάγραμμα συσκευής SEC

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΑΠΟΚΛΕΙΣΜΟΥ ΜΕΓΕΘΩΝ Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγεθών (SEC) με Ανιχνευτές RI & UV Χρωματογραφία Αποκλεισμού Μεγεθών (SEC) με Ανιχνευτές RI & DALS