Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης
Αν υποθέσουμε ότι σε κάποιο βακτηριακό κλώνο μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης έχει εισαχθεί «ανέπαφο» ένα γονίδιο, θα ήταν άραγε δυνατόν το γονίδιο αυτό να εκφραστεί; Μια cDNA βιβλιοθήκη είναι ένα σύνολο βακτηριακών κλώνων που περιέχουν αντίγραφα του mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα ( ηπατικά, παγκρεατικά, πρόδρομα ερυθροκύτταρα, κλπ)
Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης
Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης Απομόνωση ώριμου mRNA από τα κύτταρα «στόχους» Σύνθεση complementary DNA: σχηματίζονται υβριδικά μόρια mRNA-cDNA Το mRNA διασπάται με χημικές ουσίες ή αποχωρίζεται από την συμπληρωματική αλυσίδα cDNA με θέρμανση Το cDNA γίνεται δίκλωνο: Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια Τα πλασμίδια εισάγονται στα κύτταρα-ξενιστές (μετασχηματισμός βακτηρίων) καλλιέργεια των βακτηρίων σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αντιβιοτικό Προσδιορίζονται τα βακτήρια που έχουν δεχθεί πλασμίδιο . επιλογή ενός κλώνου που έχει το επιθυμητό τμήμα DNA με ειδική διαδικασία
Αντίστροφη μεταγραφάση DNA πολυμεράση Μια περιοριστική ενδονουκλεάση Ποια ένζυμα και με ποια σειρά συμμετέχουν στην κατασκευή μιας cDNA βιβλιοθήκης; Αντίστροφη μεταγραφάση DNA πολυμεράση Μια περιοριστική ενδονουκλεάση DNA δεσμάση