Μπάκα Σταυρούλα Αν. Καθηγήτρια ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΗΣΗ Μικροσκόπια Άμεση αναζήτηση μικροβίων Παρασκευάσματα - Χρώσεις Μπάκα Σταυρούλα Αν. Καθηγήτρια

OΠΤΙΚΑ (ΦΩΤΟΝΙΚΑ) ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ Χρησιμοποιούν το τμήμα του ηλεκτρομαγνητικού φάσματος που είναι ορατό, δηλαδή από 380 - 760 nm.  Ανάλογα με τη διάταξη των φακών και τον τρόπο παρατήρησης τα οπτικά μικροσκόπια διακρίνονται σε μικροσκόπια φωτεινού πεδίου, σκοτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσεως, ηλεκτρονικό, κλπ.

Αόρατοι μικροοργανισμοί  ορατοί Νωπό παρασκεύασμα ίζημα ούρων κολπικό έκκριμα κόπρανα Παρασκεύασμα με απλή χρώση Μπλε του μεθυλενίου Lugol (πρωτόζωα ή ωάρια ελμίνθων σε παρασιτολογική κοπράνων) Παρασκεύασμα με σύνθετη χρώση Gram Ziehl-Neelsen, κ.α.

Νωπό παρασκεύασμα Γίνεται ορατή η παρουσία μικροοργανισμών και διάφορα μορφολογικά χαρακτηριστικά

Trichomonas vaginalis Κίνηση, μορφολογία

Μύκητες Νωπό παρασκεύασμα με διάλυμα ΚΟΗ 10% (ξέσματα δέρματος, ονύχων ή τρίχες)

Με το οπτικό μικροσκόπιο  παρασκεύασμα με σύνθετη χρώση

Μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (dark field) Είναι ίδιο με το φωτεινού πεδίου με μόνη διαφορά ότι στο συγκεντρωτή φακό υπάρχει ένας αδιαφανής δίσκος που σκεπάζει το κέντρο του φακού με αποτέλεσμα το παρασκεύασμα να φωτίζεται μόνο από πολύ πλάγιες ακτίνες. Έτσι η εικόνα που παρατηρούμε είναι φωτεινό αντικείμενο σε σκοτεινό πεδίο. Σήμερα τα μικροσκόπια αυτά έχουν επισκιαστεί από τα μικροσκόπια αντίθεσης φάσης.

Mικροσκόπιο αντίθεσης φάσης (phase contrast) Το παρασκεύασμα φωτίζεται από ένα κενό φωτεινό κώνο που παράγεται από το δακτύλιο φάσης που βρίσκεται στο επίπεδο της ίριδας του συγκεντρωτή φακού. Θετική αντίθεση = το αντικείμενο φαίνεται φωτεινό σε σκοτεινό πεδίο ενώ το αντίθετο, που είναι και το πιο συνηθισμένο = αρνητική αντίθεση.

Μικροσκόπιο φθορισμού (fluorescent) Βασίζεται στην δυνατότητα εκπομπής φθορισμού από ορισμένες ουσίες που απορροφούν το φως μικρού μήκους κύματος (υπεριώδες φάσμα) και εκπέμπουν φως μεγαλύτερου μήκους κύματος (ορατό φάσμα).  Οι περισσότερες ουσίες ή κυτταρικές δομές δεν εμφανίζουν "πρωτογενή φθορισμό".  Έτσι αυτά τα παρασκευάσματα χρωματίζονται με φθοριοχρώματα, που αναφέρεται ως "δευτερογενής φθορισμός". Όταν το φθοριόχρωμα συνδέεται με κάποιο αντίσωμα και αυτό στη συνέχεια με το αντιγόνο, κάνοντας το τελευταίο ορατό, τότε η τεχνική αναφέρεται σαν ανοσοφθορισμός (επινοήθηκε το 1950 από τους Coons και Kaplan). 

Chlamydia trachomatis

Τεχνική sandwich Μια παραλλαγή της μεθόδου του ανοσοφθορισμού είναι και η τεχνική sandwich όπου το φθοριόχρωμα είναι ήδη συνδεδεμένο με ένα δευτερογενές αντίσωμα το οποίο στη συνέχεια προσκολλάται στο σύμπλοκο αντιγόνο / πρωτογενές αντίσωμα.

Fluorescence microscope image of the natural marine bacterial community selectively stained to show live bacteria as yellow/green and dead bacteria as red. Τwo highly fluorescent protist cells (yellow), many less fluorescent bacteria (green/yellow) and large numbers of very small viruses (pale green) Fluorescence microscopy of a Mimosa pigra nodule infected by Burkholderia (green).

Συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με ακτίνες Laser (Confocal Laser Scanning Microscope) Περιγράφτηκε για πρώτη φορά από τον Minski το 1961.  Ο φωτισμός και η παρατήρηση είναι περιορισμένα σε ένα σημείο του παρασκευάσματος.  Η εικόνα σχηματίζεται με σάρωση όλων των σημείων του πεδίου του μικροσκοπίου.  Αυτό επιτυγχάνεται με τη τοποθέτηση ενός πολύ μικρού διαφράγματος στους οπτικούς άξονες του αντικειμενικού και του συγκεντρωτή φακού.  Αποτέλεσμα τρισδιάστατες εικόνες μέσω μικροϋπολογιστή. 

Confocal laser scanning micrograph of green fluorescing fungal cells Confocal laser scanning micrograph of green fluorescing fungal cells. Staining with acridine orange. Magnification 630-fold

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο Χρησιμοποιεί δέσμη ηλεκτρονίων. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εκπομπής: για την παρατήρηση ενδοκυτταρίων δομών. Σαρωτικό ηλεκτρονικό μικροσκόπιο: για την μελέτη δομών στην επιφάνεια των κυττάρων.

An electron micrograph depicts the Trichomonas vaginalis parasite adhering to vaginal epithelial cells collected from vaginal swabs. A non-adhered parasite (right) is pear-shaped, whereas the attached parasite is flat and amoeboid. Image courtesy of: Antonio Pereira-Neves and Marlene Benchimol, Santa Ursula University, Rio de Janeiro, Brazil

SEM of a human cell infected with mycoplasma. Credit: David M. Phillips / Photo Researchers, Inc.

Χρώσεις Πρωτοχρησιμοποιήθηκαν πριν 150 χρόνια. Μέσω αυτών (+ μικροσκόπιο) γίνονται ορατά διάφορα χαρακτηριστικά όπως π.χ. μορφή, διάταξη των μικροοργανισμών, κ.α. In vivo χρώσεις (ζώντων μικροβίων – σε πολύ αραιά διαλύματα) In vitro χρώσεις (ξηρά παρασκευάσματα, όχι ζωντανά μικρόβια)

Χρώσεις Φυσικές Τεχνητές ζωικές φυτικές βασικές: κυανούν του μεθυλενίου, κρυσταλλικό ιώδες, ιώδες γεντιανής, σαφρανίνη, βασική φουξίνη, κ.α. όξινες: όξινη φουξίνη, ηωσίνη ουδέτερες: Giemsa (ηωσίνη + κρυσταλλικό ιώδες) = συνδυασμός όξινων και βασικών χρωστικών)

Gram χρώση (Hans-Christian Gram, 1884)

Clostridium perfringens Streptococcus pyogenes Lactobacillus acidophilus Clostridium tetani

Κλινικά δείγματα για χρώση Gram Δείγμα από αιμοκαλλιέργεια ΕΝΥ Δείγμα σε βαμβακοφόρο στυλεό Δείγμα από παρακέντηση, πτύελα, κόπρανα Ούρα Καλλιέργημα σε υγρό θρεπτικό υλικό Καλλιέργημα (αποικίες) από στερεό θρεπτικό υλικό

Gram χρώση (Hans-Christian Gram, 1884)