Επίκουρος Καθηγητής Σπυρίδων Ντούγιας Διάλεξη: Περιβαλλοντική Μικροβιολογία Επίκουρος Καθηγητής Σπυρίδων Ντούγιας Κυριακή 30 Οκτωβρίου 13:00-16:00 Ώρα εξ’ αποστάσεως συνεργασίας Τρίτη 1 Νοεμβρίου 9:00-10:00 Μέσο επικοινωνίας: Τηλέφωνο 25410 79313

Οικοσύστημα  πλήθος οργανισμών που ζουν σε συγκεκριμένο αβιοτικό περιβάλλον και επηρεάζεται από αυτό Γη  Το μεγαλύτερο και αύταρκες οικοσύστημα, που φυσικά περιλαμβάνει όλα τα φυτά και τα ζώα  αλληλεπίδραση με το φυσικό τους περιβάλλον. Γη  οικόσφαιρα ή βιόσφαιρα

Τα οικοσυστήματα αποτελούνται από: βιοτικά συστατικά αβιοτικά συστατικά  συντελείται ανταλλαγή ύλης και ενέργειας Αβιοτικά στοιχεία Φως & θερμοκρασία Νερό Θρεπτικά στοιχεία και ιχνοστοιχεία

Bιοτικά στοιχεία παραγωγοί καταναλωτές Αποδομητές Παραγωγοί  αυτοτροφία

Αποδομητές  οι οργανισμοί που πραγματοποιούν την αποδόμηση Κυρίως μικροοργανισμοί Βακτήρια Μύκητες Αποσύνθεση  ανοργανοποίηση Σύνθετα οργανικά  απελευθέρωση απλών ανόργανων στοιχείων

Ο κύκλος του άνθρακα

Ο οξειδοαναγωγικός κύκλος του άνθρακα

Άζωτο Ν  πρωτεΐνες, νουκλεοτίδια Ν2  σταθερή δομή  περιορισμένος αριθμός μικροοργανισμών που το δεσμεύουν ΝΟ3-, ΝΗ4+  κύριες αφομοιώσιμες μορφές Ν Νιτρικά Πλεονέκτημα: Γρήγορα αφομοιώσιμα από τα φυτά Μειονέκτημα: απορροή (leaching) (απώλειες αζώτου για τα φυτά-μόλυνση υδροφόρου ορίζοντα) Αμμωνιακά Δέσμευση από αργιλώδη εδάφη (αρνητικά φωτισμένα) Αποτελεί το 15% του αζώτου που διαφεύγει στην ατμόσφαιρα

Αζωτοδέσμευση Αζωτοδεσμευτικά βακτήρια (N2-fixing bacteria) N2+ 8H  2NH3 + H2 (νιτρογενάση - ευαίσθητη στο Ο2) Μη-συμβιωτικά αζωτοδεσμευτικά βακτήρια (free-living N2-fixing bacteria) Αερόβια (Azotobacter, Cyanobacteria) Προστασία ένζυμου: αυξημένη αναπνοή ή προστασία σε ειδικό χώρο (heterocyst) Αναερόβια (Clostridium, purple and green bacteria) Συμβιωτικά αζωτοδεσμευτικά βακτήρια (στα φυμάτια των ψυχανθών) Rhizobium, Bradyrhizobium, Frankia

Νιτροποίηση Νιτροδο- και Νιτρο-ποιητές  οξείδωση αμμωνίας σε NO2-, ΝΟ3- ΝΗ3  NO2- (Nitrosomonas) NO2-  ΝΟ3- (Nitrobacter) Νιτροποίηση: έδαφος στεγνό ουδέτερου pH & έδαφος με κοπριά

Απονιτροποίηση ΝΟ3- ως ηλεκτρονιακός δέκτης στην αναερόβια αναπνοή  αναγωγή νιτρικών σε Ν2 (ΝΟ, Ν2Ο) (Pseudomonas, Paroccocus, Bacillus) Απονιτροποίηση ως φαινόμενο ανεπιθύμητο: στη γεωργία  λόγω απομάκρυνσης αφομοιώσιμών μορφών αζώτου για τα φυτά π.χ. κατά τη λίπανση εδάφους και την επικράτηση ανοξικών συνθηκών λόγω υπερβολικής Βροχόπτωσης στη ατμόσφαιρα  λόγω φωτοχημικής μετατροπής Ν2Ο σε ΝΟ  αντίδραση ΝΟ με Ο3 προς ΝΟ2- και επιστροφή στη γη ως ΗΝΟ2 (καταστροφή όζοντος και όξινη βροχή) Απονιτροποίηση ως φαινόμενο επιθυμητό: στην απομάκρυνση αζώτου κατά τη διαχείριση υγρών αποβλήτων και αποφυγή υπερτροφισμού σε λίμνες

Αµµωνιοποίηση ή ανοργανοποίηση του οργανικού αζώτου Απελευθέρωση αμμωνίας κατά την διάσπαση οργανικών αζωτούχων συστατικών όπως αμινοξέα και νουκλεοτίδια Απελευθέρωση αμμωνίας κατά την αερόβια αποδόμηση οργανικών συστατικών Εδάφη με αλκαλικό pH Εδάφη με όξινο ή ουδέτερο pH ΝΗ4+ ΝΗ3  (σε στάβλους κλπ) Αφομοιώσιμο από τα φυτά

Anammox (Anoxic Ammonia oxidation-Ανοξική οξείδωση της αμμωνίας) Anammox: Brocadia spp. (σε ιζήματα και αποχετευτικό) NH3 + NO2- + H+  Ν2 + 2Η2Ο

Ο κύκλος του αζώτου

Ο οξειδοαναγωγικός κύκλος του αζώτου

Αναερόβια αναπνοή με νιτρικό και θειικό Ο2  ο κύριος ηλεκτρονιακός δέκτης λαμβάνοντας e- από NADH και FADH2 (αερόβια αναπνοή) Αντί του Ο2 μπορεί να χρησιμοποιηθούν και άλλοι ηλεκτρονιακοί δέκτες κυρίως ΝΟ3- και SΟ42- (αναερόβια αναπνοή) Απονιτροποίηση (denitrification) Αναπνοή με νιτρικά με τελικό προϊόν της αναγωγής το Ν2  απονιτροποίηση Αποθειικοποίηση (desulfurication) Αναπνοή με θειικό με τελικό προϊόν της αναγωγής το Η2S  αποθειικοποίηση

Απονιτροποίηση NO3- μετατρέπονται σε Ν2Ο και N2  αέρια που απελευθερώνονται στην ατμόσφαιρα Απονιτροποίηση Ανεπιθύμητη για τη γεωργία λόγω απωλειών σε N Επιθυμητή στα υγρά απόβλητα – αποφυγή ευτροφισμού

Υποχεωτικοί αναερόβιοι μικροοργανισμοί-Μεθανογόνοι CH4  Μικροβιολογικό ενδιαφέρον  μεθανογόνοι  Αρχαία Μεθανογόνα αρχαία  αναερόβιες συνθήκες (redox  -370 έως -480) Αυτότροφα (Η2/CΟ2) Μεθανογόνα Ετερότροφα (ενώσεις μικρού μοριακού βάρους) Methanosarcina barkeri, Methanothrix spp. κλπ

Μεθανιογένηση από οργανικές μεγαλομοριακές ενώσεις Φάσμα υποστρωμάτων  περιορισμένο Βιομεθανοποίηση  τελευταίο κρίκο της αναερόβιας τροφική αλυσίδας Μετατροπή σύνθετων οργανικών ενώσεων Εμπλοκή δύο ομάδων μικροοργανισμών

Μεγαλομοριακές ενώσεις  υδρολυτική μετατροπή Οξεογένεση ζύμωση μέσω οξεογόνων βακτηρίων (acidogens- fermentative bacteria) Χαμηλομοριακά οργανικά οξέα και αλκοόλες (96%) + [Η2/CO2 και CH3COOH (4%) ] Οξικογένεση Οξικογόνοι (acetogens) CH3COOH + H2 / CO2 μεθανογένεση μεθανιογόνοι (methanogens) CH4

Όρια αναερόβιου μεταβολισμού Δύο κατηγορίες υποστρωμάτων δε μπορούν να υποστούν ζύμωση λιγνίνη Αλιφατικοί υδρογονάνθρακες (ανθεκτικοί στην αναερόβια αποδόμηση- Πετρέλαιο σταθερό στη φύση) (διατήρηση λιθάνθρακα για αιώνες) Αρωματικοί υδρογονάθρακες  διάσπαση από μικτές καλλιέργειες οξικογόνων και υδρογονότροφων μεθανογόνων μικροοργανισμών (περιορισμός αρωματικών συστατικών στο πετρέλαιο)

Θρέψη και Φυσιολογία Μικροοργανισμών Παράγοντες που επηρεάζουν την ανάπτυξη μικροοργανισμών Σύσταση θρεπτικών και ενεργειακό υπόστρωμα Πηγή άνθρακα pH Θερμοκρασία Απαιτήσεις σε οξυγόνο Ωσμωτική πίεση (αλατότητα και σάκχαρα) Πίεση

Γνώση των παραγόντων που επηρεάζουν την ανάπτυξη μικροοργανισμών Κατανόηση μεταβολισμού Ανάπτυξη βιολογικών διαδικασιών για την προστασία του περιβάλλοντος (π.χ. απομάκρυνση οργανικών υποστρωμάτων, νιτροποίηση/απόνιτροποίηση, αποφωσφόρωση) μικροβιακή οικολογία Μέσω της επίδρασης των εξωτερικών περιβαλλοντικών συνθηκών και τη σύσταση ή τον περιορισμό των θρεπτικών συστατικών τελείται ο έλεγχος του μικροβιακού πληθυσμού

Τροφική κατάταξη μικροοργανισμών Ηλιακή ενέργεια  φωτοσυνθετικοί οργανισμοί  παρέχεται ενέργεια που μετατρέπεται σε δυναμική ενέργεια μέσω των δεσμών των σχηματιζόμενων χημικών ενώσεων Για την παραλαβή ενέργειας τα κύτταρα πρέπει να έχουν έναν ηλεκτρονιακό δότη (ανηγμένες χημικές ενώσεις) (Η2Ο, S, Η2S, Η2 -hν) Οργανικές ενώσεις (υδατάνθρακες, λίπη, πρωτεΐνες) Ανόργανες ενώσεις (ΝΗ3, ΝO2-, Η2S, S, S2Ο32-, H2, Fe2+) Μεταφορά ηλεκτρονίων σε συνένζυμα (NAD+, NADP+, FAD) –παραγωγή μικρών ποσοτήτων ATP Μεταφορά ηλεκτρονίων στους τελικούς ηλεκτρονιακούς δέκτες από τα ανηγμένα συνένζυμα (NADΗ, NADPΗ, FADΗ2)

Τροφικός τύπος Πηγή ενέργειας Πηγή άνθρακα Παραδείγματα φωτοαυτότροφοι h.v. CO2 α) φύκη και β) φωτοσυνθετικά βακτήρια (κυανοβακτήρια, πράσινα και ιώδη βακτήρια του θείου) φωτοετερότροφοι οργανικές ενώσεις μερικά πράσινα και ιώδη βακτήρια του θείου χημειοαυτότροφοι NH3, NO2-, H2, H2S, S, Fe2+ νιτροποιητικοί μικροοργανισμοί, οξειδωτικά βακτήρια του θείου, του υδρογόνου και του σιδήρου χημειοετερότροφοι τα περισσότερα βακτήρια, όλοι οι μύκητες και τα πρωτόζωα

Φωτοαυτότροφοι ή φωτολιθότροφοι Πηγή ενέργειας  φως Πηγή άνθρακα  CO2 Φωτοσυνθετικά βακτήρια  Πράσινα και ιώδη βακτήρια θείου κυανοβακτήρια Φύκη (άλγη) Κυανοβακτήρια και φύκη  χρησιμοποιούν τα άτομα υδρογόνου του νερού για την αναγωγή CO2 ενώ παράγονται ταυτόχρονα Ο2 Η φωτοσυνθετική αυτή διαδικασία χαρακτηρίζεται ως οξυγονογενής Πράσινα και ιώδη βακτήρια θείου  απαιτούν αναερόβιες συνθήκες και δεν φωτοσυνθέτουν παρουσία Ο2  χρησιμοποιούν S, Η2S και H2 για την αναγωγή του CO2 (οξειδώνοντας S ή S2- προς SO42-, και Η2 σε Η2Ο) Η φωτοσυνθετική αυτή διαδικασία χαρακτηρίζεται ως μη οξυγονογενής

Χαρακτηριστικά Ευκαρυωτικά Προκαρυωτικά φύκη κυανοβακτήρια πράσινα βακτήρια του θείου ιώδη βακτήρια του θείου αναγωγή CO2 Η του H2O S, H2S, H2 παραγωγή O2 + - χρωστικό που συλλαμβάνει h.v χλωροφύλλη α βακτηριοχλωροφύλλη α,β περιβάλλον αερόβιο αναερόβιο

Φωτοετερότροφοι ή φωτοοργανότροφοι Πηγή ενέργειας  φως Πηγή άνθρακα  αλκοόλες, λιπαρά οξέα, άλλα οργανικά οξέα και υδατάνθρακες Φωτοετερότροφα βακτήρια  Μερικά πράσινα και ιώδη βακτήρια θείου Χημειοαυτότροφοι ή χημειολιθότροφοι Πηγή ενέργειας  ηλεκτρόνια ανηγμένων ανόργανων ενώσεων (H2S, S, NH3, NO2-, H2, Fe2+) Πηγή άνθρακα  CO2 Μόνο προκαρυωτικά μέλη

Χημειοετερότροφοι ή χημειοοργανότροφοι Πηγή ενέργειας και άνθρακα  ταυτόσημες (ενεργειακό υπόστρωμα και υπόστρωμα άνθρακα είναι το ίδιο) χρησιμοποιούν ηλεκτρόνια ατόμων υδρογόνου σε οργανικές ενώσεις Πρωτόζωα, μύκητες και τα πιο πολλά βακτήρια

Επίδραση περιβαλλοντικών παραγόντων pH Θερμοκρασία Συγκέντρωση οξυγόνου Ωσμωτική πίεση (αλατότητα και σάκχαρα) Υδροστατική πίεση

Συγκέντρωση οξυγόνου Ο2  α) ως επίδραση στην ανάπτυξη μικροοργανισμών β) ως δυνατότητα να χρησιμοποιηθεί ως τελικός ηλεκτρονιακός δέκτης Υποχρεωτικά αερόβιοι  ανάπτυξη στις επικρατούσες συνθήκες ατμοσφαιρικής πίεσης ή σε κορεσμένο με Ο2 διάλυμα Μικροαερόφιλοι  αερόβιοι μικροοργανισμοί που χρησιμοποιούν το Ο2 μόνο σε χαμηλά επίπεδα (σε σχέση με τις επικρατούσες ατμοσφαιρικές συνθήκες) Περιορισμένη αναπνευστική ικανότητα Μόρια ευαίσθητα σε υψηλές [Ο2] Αερόβιοι και Μικροαερόφιλοι χρησιμοποιούν το Ο2 ως τελικό ηλεκτρονιακό δέκτη (ΤΗΔ) (αερόβια αναπνοή)

Αναερόβιοι μικροοργανισμοί (δεν χρησιμοποιούν το Ο2 ως ΤΗΔ) 1. Υποχρεωτικά αναερόβιοι  καταστρέφονται από το Ο2 2. αεροανθεκτικοί  αντέχουν παρουσία Ο2 αν και δεν το χρησιμοποιούν Προαιρετικά αναερόβιοι Ζουν παρουσία και απουσία οξυγόνου Χρησιμοποιούν εκτός του Ο2, νιτρικά και θειικά άλατα ως ΤΗΔ

Θερμοκρασία Θερμοκρασία  επιδρά στο ρυθμό βιοχημικών αντιδράσεων – στην βιοχημεία ΚTw=K20 θ(ΤW-20) Θ=1.03 Τw, η εκάστοτε θερμοκρασία Όρια ανάπτυξης μικροοργανισμού  μέγιστη και ελάχιστη θερμοκρασία Άριστη-βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης  μέγιστος ρυθμός ανάπτυξης Το εύρος και η βέλτιστη Τ ανάπτυξης διαφέρουν από στέλεχος σε στέλεχος, και εξαρτάται από: Α. στάδιο ανάπτυξης-ηλικία καλλιέργειας Β. τροφική κατάσταση περιβάλλοντος

Ο ρυθμός των βιοχημικών αντιδράσεων αυξάνει με την αύξηση της θερμοκρασίας Έως ορισμένου σημείου όπου λόγω μετουσίωσης πρωτεϊνών αρχίζει επιβράδυνση και τελικά ολική αναστολή Πραγματοποιείται βαθμιαία μετουσίωση πρωτεϊνών και έτσι η αδρανοποίηση είναι σταδιακή Τα πιο ευαίσθητα ενζυμικά συστήματα είναι εκείνα της αναπαραγωγής Χαρακτηρισμός μικροοργανισμών ως προς την βέλτιστη θερμοκρασία Ψυχρόφιλοι, <15οC Μεσόφιλοι, 20 έως 40-45οC Θερμόφιλοι, 45 έως 80οC Υπερθερμόφιλοι, >80οC Ψυχρότροφοι, βέλτιστη >20οC- ελάχιστο κοντά στο 0οC

Προσαρμογή θερμόφιλων  - θερμοάντοχα ένζυμα - ταχύτερη παραγωγή ενζύμων λόγω γρηγορότερης μετουσίωσης - Λιπαρά οξέα Προσαρμογή ψυχρόφιλων  ένζυμα παρόμοιας αντοχής με εκείνα των θερμόφιλων Προσαρμογή ψυχρόφιλων  Λιπαρά οξέα των μεμβρανών

pH pH φυσικών υδάτων 5-9 Ως προς το εξωκυτταρικό pH (ενδοκυτταρικό πλησίον του ουδέτερου pH): Ουδετερόφιλοι Βασεόφιλοι (Αλκαλόφιλοι) (άριστο pH >9), π.χ. Bacillus spp. Οξεόφιλοι ή Οξόφιλοι (άριστο pH <5.5-6 π.χ. Acidothiobacillus, Sulfolobus, Thermoplasmata Μηχανισμοί άντλησης πρωτονίων μέσω ATPαση (εδώ κατανάλωση ATP αντί σχηματισμού)

Ωσμωτική και υδροστατική πίεση Μικροοργανισμοί  συνήθως μεγαλύτερη συγκέντρωση διαλυτών μορίων στο εσωτερικό Θετική ωσμωτική πίεση Εσωτερική ωσμωτική πίεση: Gram(+) 20 Atm Gram(-) 5-10 Atm Μείωση ωσμωτικής πίεσης μέσω μείωσης της συγκέντρωσης των μικρών μορίων και μετατροπής αυτών σε αποθηκευτικά μόρια (λίπη, πολυσακχαρίτες κλπ) Μηχανισμός ρύθμισης  ειδάλλως είσοδος νερού και διόγκωση (σπαργή) Βακτήρια, μύκητες και φύκη  προστατευτικό κυτταρικό τοίχωμα Πρωτόζωα  απουσία κυτταρικού τοιχώματος  το νερό απωθείται με συσπάσεις του κενοτοπίου (απαιτείται ενέργεια)

Χαμηλή ωσμωτική πίεση στο περιβάλλον  είσοδος νερού στο κυτταρόπλασμα  διόγκωση κυττάρου (σπαργή) Υψηλή ωσμωτική πίεση στο περιβάλλον  απώλεια νερού από το κυτταρόπλασμα  συρρίκνωση κυττάρου (πλασμόλυση) Υψηλή αλατότητα ή συγκέντρωση σακχάρων  συντήρηση τροφίμων Ωσμώφιλοι ή αλόφιλοι  προσαρμοσμένοι σε συνθήκες υψηλής ωσμωτικής πίεσης Αλόφιλοι  απαιτούν αλάτι για να ζήσουν (ελαφρώς αλόφιλοι, έως 1-6% - μετριώς αλόφιλοι έως 7-15% -εξαιρετικά αλόφιλοι, 15-30% Αλοανθεκτικοί  δεν απαιτούν αλάτι για να ζήσουν αλλά ζουν έως 15-20% ΝaCl

Πιεσόφιλα ή Βαρόφιλα Βαρόανθεκτικά  καλύτερη ανάπτυξη στην 1 Αtm αντί στις 300 Atm –Δεν ζουν >500 Atm Βαρόφιλα καλύτερη ανάπτυξη στις 300-400 Αtm αντί στις 1 Atm –ζουν στην 1 Atm Εξαιρετικά Βαρόφιλα  ανάπτυξη στις 700-400 Αtm έως και στις 1035 Atm –Moritella Δεν ζει στην 1 Atm

Αναπτυξιακός κύκλος μικροβιακών καλλιεργειών Οι προηγούμενες εξισώσεις εφαρμόζονται μόνο στη λογαριθμική φάση ανάπτυξης που είναι σύντομη Αν διατηρούνταν επί μακρό χρονικό διάστημα η εκθετική ανάπτυξη τότε π.χ. με χρόνο διπλασιασμού 20 min και εκθετική φάση για 48 h το βάρος τα ων απογόνων θα ήταν 4000 της μάζας της γης Παράγοντες περιορισμού της μικροβιακής ανάπτυξης Εξάντληση θρεπτικού υποστρώματος Συσσώρευση τοξικών προϊόντων μεταβολισμού Γενετικό γνώρισμα

Διαλείπουσα καλλιέργεια (batch culture) Διαλείπουσα ή κλειστή καλλιέργεια  καλλιέργεια σε δοχείο που μπορεί να αναδεύεται (ή και όχι) χωρίς εισροή και εκροή διαλύματος Φάσης ανάπτυξης κλειστής καλλιέργειας βακτηρίων -Λανθάνουσα φάση ή φάση υστέρησης (lag phase) - Λογαριθμική ή εκθετική φάση (exponential or log or logarithmic phase) - Φάση στασιμότητας (stationary phase) - Φάση θανάτου ή απόπτωσης (death phase)

Λανθάνουσα φάση ή φάση υστέρησης (lag phase) Υστέρηση στην ανάπτυξη αμέσως μετά τον εμβολιασμό  προσαρμογή του μικροοργανισμού (βιοσύνθεση κατάλληλων ενζύμων, προσαρμογή μεμβρανών κλπ) Ο χρόνος της λανθάνουσας φάσης εξαρτάται από Α. το είδος του μικροοργανισμού Β. τις συνθήκες του περιβάλλοντος Γ. το θρεπτικό υλικό Δ. την προϊστορία της καλλιέργειας (π.χ. η φάση ανάπτυξης από την οποία παραλήφθηκε το εμβόλιο, η ποσότητα του εμβολίου, η κατάσταση των κυττάρων του εμβολίου)

Λογαριθμική ή εκθετική φάση (exponential or log or logarithmic phase) Η φάση έχει περιγραφεί αναλυτικά μ εξαρτάται από Τ, pH, σύσταση διαλύματος κλπ Προκαρυωτικοί αυξάνονται γρηγορότερα έναντι ευκαρυωτικούς- Μικροί ευκαρυωτικοί αυξάνονται γρηγορότερα έναντι μεγάλων ευκαρυωτικών

Συσσώρευση προϊόντων με ανασταλτική δράση Φάση στασιμότητας (stationary phase) Η λογαριθμική ανάπτυξη δεν συνεχίζεται επ’ αόριστον  στη φάση αυτή ο ρυθμός ανάπτυξης μειώνεται έως μηδενισμού Μείωση του ρυθμού διαίρεσης των κυττάρων σε σχέση με την εκθετική φάση Έλλειψη θρεπτικών Συσσώρευση προϊόντων με ανασταλτική δράση σε ένα κρίσιμο σημείο Στη φάση αυτή ο αριθμός κυττάρων παραμένει σταθερός Συνεχίζονται οι κυτταρικές λειτουργίες διατήρησης όπως ενεργός μεμβρανική μεταφορά, διατήρηση ιοντικών δυναμικών, ATP-σύνθεση

Μειώνεται ο διαθέσιμός C προκαλώντας την λύση μερικών κυττάρων  Απελευθερώνονται συστατικά, όπως πρωτεΐνες, λιπίδια και υδατάνθρακες κατά τη λύση αυτών που χρησιμοποιούνται ως θρεπτικά από άλλα κύτταρα («κανιβαλισμός») Διατήρηση αριθμού κυττάρων σταθερό (ούτε αύξηση ούτε μείωση)  Το φαινόμενο αυτό είναι γνωστό ως «κρυπτή» ανάπτυξη

Φάση θανάτου ή απόπτωσης (death phase) Μείωση του αριθμού των κυττάρων Α. το είδος του μικροοργανισμού Β. τις συνθήκες του περιβάλλοντος Γ. συσσώρευση τοξικών συστατικών