Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος Άσκηση 3 Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος Ρ. Τσιτσιλώνη, Λ. Φωτεινοπούλου, Σ. Παπαβασιλείου

κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών) Έμμορφα στοιχεία του αίματος μυελική σειρά κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών) μονοβλαστική σειρά λεμφική σειρά

Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος Θύμος ?

Απομόνωση μονοπύρηνων αίματος Επιστίβαση πλάσμα PBMC Ficoll-Paque

Μέτρηση μονοπύρηνων αίματος Ανάμειξη PBMC με Trypan blue

Αιμοκυτταρομέτρο (πλάκα Neubauer) (1/5x1/5x1/10) 1x1x1/10

Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος ?

Mορφολογία μακροφάγων

Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων Σινική μελάνη

Δ1: Απομόνωση λεμφοκυττάρων Σε γυάλινο σωληνάριο βάζουμε: 3 ml Ficoll-Paque Επιστιβάζουμε προσεκτικά 4 ml αίματος αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Φυγοκέντρηση: 1800 στροφές, 20 λεπτά Αφαιρούμε προσεκτικά το πλάσμα με πιπέττα Pasteur (πετάμε) Συλλέγουμε τη στιβάδα των λεμφοκυττάρων/PBMC με την ίδια Pasteur Μεταφέρουμε τα λεμφοκύτταρα/PBMC σε πλαστικό σωληνάριο (λεμφ.) Προσθέτουμε 5 ml διάλυμα αλάτων Φυγοκέντρηση: 1400 στροφές, 10 λεπτά (ξέπλυμα Ficoll) Διαλυτοποιούμε προσεκτικά το ίζημα των λεμφοκυττάρων/PBMC Επαναιωρούμε σε 1 ml διαλύματος αλάτων

Δ2: Προσδιορισμός νεκρών-ζωντανών λεμφοκ. Στο γυάλινο σωληνάριο (χωρίς ένδειξη) αναμειγνύουμε: 0,45 ml εναιωρήματος λεμφοκυττάρων/PBMC 0,05 ml χρωστικής Trypan blue Τοποθετούμε μικρό δείγμα σε πλάκα Neubauer (και στις δύο θέσεις μέτρησης) Στις περιοχές μέτρησης λευκοκυττάρων (τουλάχιστον σε 2/4): μετρούμε τα ζωντανά λεμφοκύτταρα/PBMC (άχρωμα) μετρούμε τα νεκρά λεμφοκύτταρα/PBMC (βαμμένα μπλε)

Δ3: Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων περιτοναϊκής κοιλότητας Θα απομονώσουμε μακροφάγα: Ενίουμε 10 ml φυσιολογικού ορού στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού Αναρρόφηση υγρού, συλλογή σε γυάλινο σωληνάκι Φυγοκέντρηση: 1300 rpm για 5 min Επαναδιάλυση σε 0,5-1 ml φυσιολογικό ορό και μέτρηση Θα προσθέσουμε σε αντικειμενοφόρο πλάκα: 1 σταγόνα εναιωρήματος μακροφάγων στο κέντρο 1 σταγόνα διαλύματος σινικής μελάνης, ανάδευση Παρατήρηση στο μικροσκόπιο-εστίαση σε ένα πεδίο-παρατήρηση ανά 15 min Χρόνος χρωματισμού μακροφάγου ~ 1-5 sec Χρόνος αποχρωματισμού μακροφάγου ???

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (Ι) Δ1: αριθμός λεμφοκυττάρων/PBMC ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος για την ομάδα σας θεωρητικός υπολογισμός αναλυτικά Δ2: αριθμός ζωντανών λεμφοκυττάρων/PBMC αριθμός νεκρών λεμφοκυττάρων/PBMC % αναλογία ζωντανών-νεκρών για την ομάδα σας Δ3: σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση χρωστικής χρόνος αποχρωματισμού για την ομάδα σας

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙ) Για το φυλλάδιό σας Άσκηση: Πόσα λεμφοκύτταρα/PBMC θα έπρεπε θεωρητικά να έχετε μετρήσει στο ένα τετράγωνο (0,1 mm3) της πλάκας Neubauer? Λεμφοκύτταρα/PBMC ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος όπως τα μετρήσατε στο δείγμα σας % αναλογία ζωντανών και νεκρών λεμφοκυττάρων/PBMC στο δείγμα σας Σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση σινικής μελάνης 5. Χρόνος αποχρωματισμού (ή ποσοστό περίπου) του μακροφάγου

Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙΙ) Θεωρητική άσκηση: Έχω 4 ml αίμα προβάτου αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Διαχωρίζω επιστοιβάζοντας το αίμα σε 3 ml Ficoll-Paque Ξεπλένω με 5 ml διάλυμα αλάτων Επαναιωρώ σε 1 ml διάλυμα αλάτων Παίρνω 0,45 ml εναιώρημα PBMC + προσθέτω 50 μl χρωστικής Trypan blue Mετρώ σε 1 πλευρικό τετράγωνο (0,1 mm3) της Neubauer Αν δεν έχω πουθενά απώλειες, πόσα PBMC θα μετρήσω ???? Ξέρουμε ότι: το πρόβατο έχει 12.000 WBC / mm3 από τα WBC: το 40 % είναι λεμφοκύτταρα, το 1% βασεόφιλα, το 53% ουδετερόφιλα, το 1% ηωσινόφιλα και το 5% μονοκύτταρα