ΕΘΝΙΚΟ & ΚΑΠΟΔΙΣΤΡΙΑΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ & ΙΑΤΡΙΚΗ ΣΧΟΛΗ Μ.Δ.Ε «Εφαρμογές της Βιολογίας στην Ιατρική» «Γενικές στρατηγικές για αλληλούχιση πλήρων γονιδιωμάτων, ιστορικά στοιχεία, η σημερινή εικόνα» Εργασία στο μάθημα : «Μοριακή βιολογία –Αρχές & Μεθοδολογία» ΤΣΙΜΠΛΑΚΗ ΕΛΠΙΔΑ

Προγράμματα γονιδιωματικής Φιλόδοξα έργα μεγάλης κλίμακας που στοχεύουν στην ανάλυση ολόκληρων γονιδιωμάτων Περιλαμβάνουν τη χαρτογράφηση όλων των γονιδίων ενός είδους και οδηγούν στον καθορισμό της πλήρους αλληλουχίας του γονιδιώματός του Τα προγράμματα γονιδιωματικής συνήθως χωρίζονται σε δύο φάσεις : - γονιδιακή χαρτογράφηση (genome mapping projects) - αλληλούχιση γονιδιώματος (genome sequence projects)

Γονιδιακή χαρτογράφηση Προγράμματα γονιδιωματικής Γονιδιακή χαρτογράφηση Γενετική παρουσιάζει τη σχετική θέση γονιδίων και δεικτών κατά μήκος ενός χρωμοσώματος που καθορίζεται με βάση τη συχνότητα ανασυνδυασμού ανάμεσά τους Φυσική παρουσιάζει την πραγματική θέση γονιδίων και δεικτών κατά μήκος ενός χρωμοσώματος και προέρχεται άμεσα από την ανάλυση του DNA Είδη φυσικού χάρτη: -Χάρτης περιορισμού (restriction map) -Χάρτης STS (sequence tagged site)

Αλληλούχιση γονιδιώματος Προγράμματα γονιδιωματικής Αλληλούχιση γονιδιώματος Ανάγνωση ολόκληρης της αλληλουχίας των τεσσάρων διαδοχικών βάσεων που αποτελούν το γονιδίωμα ενός οργανισμού Απώτερος σκοπός ενός προγράμματος γονιδιωματικής Δύο στρατηγικές : -map based sequencing -whole genome shotgun sequencing

Στρατηγικές αλληλούχισης Γενικά Το μεγαλύτερο εμπόδιο είναι η ποσότητα του DNA που πρέπει να αναλυθεί Ακόμα και το γονιδίωμα των μικρότερων οργανισμών είναι πολύ μεγάλο και δύσκολο να μελετηθεί Κατακερματισμός γενωμικού DNA σε θραύσματα διαφόρων μοριακών μεγεθών Κλωνοποίηση σε κατάλληλους φορείς (vectors) και κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών (gDNA libraries) Καθορισμός αλληλουχίας ένθετων τμημάτων χωριστά Ανακατασκευή ολόκληρης της αρχικής αλληλουχίας με βάση την αλληλουχία που καθορίστηκε για όλα τα μικρότερα τμήματα

Στρατηγικές αλληλούχισης Κατασκευή γονιδιωματικών βιβλιοθηκών Φορείς (vectors) - βακτηριακά πλασμίδια (~ 10 kb) - κοσμίδια (~ 15 kb) - DNA φάγων (~ 15 kb) - PAC (P1 Artificial Chromosome, ~ 200kb) - BAC ( Bacterial Artificial Chromosome, ~ 200 kb) - YAC ( Yeast Artificial Chromosome, ~ 2000 kb)

Στρατηγικές αλληλούχισης – Map based sequencing Βασική στρατηγική του δημοσίου προγράμματος για την αλληλούχιση του ανθρωπίνου γονιδιώματος (National Institutes of Health) κατασκευή φυσικού χάρτη, του προς αλληλούχιση γονιδιώματος με σκοπό την δημιουργία ενός contig κλώνων συστοιχία DNA κλώνων με μερικώς επικαλυπτόμενα ένθετα τμήματα μπορούν να καλύπτουν ολόκληρα χρωμοσώματα από τη μια άκρη στην άλλη το έργο της αλληλούχισης του γονιδιώματος είναι πολύ πιο εύκολο αν υπάρχει συστοιχία διατεταγμένων κλώνων

Στρατηγικές αλληλούχισης – Map based sequencing Κατασκευή contigs Chromosome walking (βάδισμα επί του χρωμοσώματος) Κατασκευή γονιδιωματικής βιβλιοθήκης Απομόνωση γενωμικού κλώνου από τη γονιδιωματική βιβλιοθήκη και καθορισμός της αλληλουχίας του Απομόνωση δεύτερου κλώνου που μερικώς επικαλύπτεται με τον πρώτο από την ίδια βιβλιοθήκη Προσδιορισμός της αλληλουχίας του δεύτερου κλώνου και στοίχιση με τον πρώτο (alignment) κ.λ.π

Στρατηγικές αλληλούχισης – Map based sequencing Πέψη του γονιδιώματος σε μεγάλα και μεσαίου μεγέθους τμήματα Κλωνοποίηση τμημάτων σε φορείς και δημιουργία BAC βιβλιοθηκών Απομόνωση και ανάλυση BAC κλώνων Οργάνωση BAC κλώνων σε φυσικό χάρτη Δημιουργία contigs κλώνων Διάσπαση των BAC κλώνων σε μικρότερα τμήματα και αυτοματοποιημένη ανάλυση της αλληλουχίας τους Γραμμική διευθέτηση των τμημάτων βάσει των ακραίων δομικών τους επικαλύψεων Αποδοτική σε μεγάλα γονιδιώματα

Στρατηγικές αλληλούχισης – Whole genome shotgun sequencing Βασική στρατηγική του ιδιωτικού προγράμματος για την αλληλούχιση του ανθρωπίνου γονιδιώματος (Celera Genomics) J. Craig Venter Ανάπτυξη υψηλής υπολογιστικής ικανότητας ειδικών αλγορίθμων The Institute for Genomic Research (TIGR) Celera Genomics

Στρατηγικές αλληλούχισης – Whole genome shotgun sequencing Κατακερματισμός του γονιδιώματος σε τμήματα μικρού μοριακού μεγέθους Κλωνοποίηση τμημάτων σε φορείς Προσδιορισμός αλληλουχίας ένθετου τμήματος κάθε κλώνου της βιβλιοθήκης Εύρεση κοινών περιοχών ανάμεσα σε κλώνους Αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματος βάσει των αλληλουχιών του τεράστιου αριθμού των επικαλυπτόμενων κλώνων Μεγάλη υπολογιστική ισχύ Αποδοτική σε σχετικά μικρά γονιδιώματα (βακτηριακά)

Whole genome shotgun sequencing Map based sequencing Whole genome shotgun sequencing genome Random reads assembly anchoring Genome assembly

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής Haemophilus Influenzae 1995 TIGR (The Institute for Genome Research) J. Craig Venter Whole Genome Shotgun

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής S. Cerevisiae 1997 : πρόχειρη γραφή 1999 : πλήρης αλληλουχία Συνεργασία μεγάλων ερευνητικών κέντρων Whole genome shotgun

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής C. elegans Δεκέμβριος 1998 Sanger Institute Genome Sequence Center (Washington University) Whole genome shotgun

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής Drosophila melanogaster 2000 Celera Genomics Whole genome shotgun

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής Mus musculus 2002 : πρόχειρη γραφή Celera Genomics Genome Sequence Center (Washington University) Sanger Institute Whole genome shotgun

Ιστορική αναδρομή προγραμμάτων γονιδιωματικής Homo sapiens 2001 : πρόχειρη γραφή 2006 : πλήρης αλληλουχία Celera Genomics NIH (National Institutes of Health) Whole genome shotgun + Map based sequencing

Genome sequencing projects (5/2009) Η σημερινή εικόνα Genome sequencing projects (5/2009) 574 Eukaryotic Genome Sequencing Projects In progress - 292 Complete - 24 Assembly - 258 Microbial Complete - 884

Ευχαριστώ