ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ Μ.Δ.Ε. «ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ» Μάθημα: Μοριακή Βιολογία - Αρχές και Μεθοδολογία Πολυγονιδιακές οικογένειες (δομή, οργάνωση και γενικές αρχές συντονισμένης έκφρασης) Ευσεβεία Φρακολάκη

Ορισμός Σύνολο παρόμοιων ή πανομοιότυπων γονιδίων προερχόμενα από κοινό πρόγονο.

Οι πολυγονιδιακές οικογένειες εντοπίζονται στο ενδιάμεσα επαναλαμβανόμενο DNA. Πειράματα κινητικής ανασύνδεσης: Ψαλιδισμένο (π.χ με υπερήχους ή υψηλή πίεση) DNA μήκους κομματιών ~500 bp αποδιατάσσεται θερμικά Ανασύνδεση (όχι αναδιάταξη!) με τυχαία σύγκρουση των απόλυτα ή μερικά συμπληρωματικών αλυσίδων. Ο ρυθμός ανασύνδεσης εξαρτάται από το χρόνο (t) αλλά και την αρχική συγκέντρωση του DNA (C0) – Τιμή C0t Το ανθρώπινο, αλλά και όλα τα πολύπλοκα γονιδιώματα εμφανίζουν 3 κλάσματα: Επαναλαμβανόμενο DNA (10%) – γρήγορα ανασυνδεόμενο. Ενδιάμεσα επαναλαμβανόμενο (30%) – ενδιάμεσα ανασυνδεόμενο. Μη επαναλαμβανόμενο, (60%) – αργά ανασυνδεόμενο.

Εντοπισμός μελών πολυγονιδιακών οικογενειών Αλληλούχηση DNA Υβριδοποίηση DNA PCR - εκφυλισμένοι εκκινητές DNA sequencing – Άμεσος υπολογισμός του βαθμού συγγένειας αλληλουχιών των μελών μιας οικογένειας. DNA hybridization. Ιχνηθέτης από ένα μέλος πολυγονιδιακής οικογένειας typically gives a complex band pattern when hybridized against a Southern blot of genomic DNAs. PCR cloning – Επιτρέπει αναγνώριση των μελών μιας οικογένειας με το σχεδιασμό εκφυλισμένων ιχνηθετών (degenerate primers) corresponding to highly conserved nucleotide or amino acid sequences.

Blast

Πηγή: http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/Isolat_analyz_genes_Chpt3.htm Blot-hybridization analysis of clones of genomic DNA and genomic DNA showing that mutliple copies of genes are present. A set of overlapping clones containing rabbit genomic DNA were digested and run on an agarose gel (panel A), blotted onto a membrane and hybridized with a radiolabeled probe that detected embryonic hemoglobin genes, and exposed to X-ray film. The resulting autoradiogram is shownin panel B. Panel C shows the results of a blot-hybridization analysis of rabbit total genomic DNA, using the same probe. Many of the same bands are seen as in the cloned DNA, confirming the existence of multiple hybridizing fragments. Mapping the fragments showed that they represented separate genes. Πηγή: http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/Isolat_analyz_genes_Chpt3.htm

Πηγή: http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/HYDEN.htm A primer is degenerate if some of its positions admit more than one nucleotide. It is in fact a mixture of unique primers. For example, AAC{G,T}G{A,C,G}G is a 7-long degenerate primer, in which the fourth and sixth positions are degenerate. It corresponds to the primers AACGGAG, AACGGCG, AACGGGG, AACTGAG, AACTGCG, AACTGGG. Degenerage primers can be used in PCR reactions to amplify many related sequences from genomic DNA or from cDNA libraries. They can be used when some of the related genomic sequences are unknown, or known only in a related species. Πηγή: http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/HYDEN.htm

Ταξινόμηση Απλές αλληλουχίες: Μικρές πανομοιότυπες μη μεταγραφόμενες με μεγάλο αριθμό αντιγράφων (δορυφορικό, μίνι- και μικρο-δορυφορικό DNA). Πολλαπλασιαστικές: Μεγάλος αριθμός πανομοιότυπων ή σχεδόν πανομοιότυπων αντιγράφων, μεταγράφονται και μεταφράζονται (ιστόνες) ή όχι (rRNA) Πληροφοριακές: Τα μέλη διαφέρουν, μεταγράφονται και μεταφράζονται

Α. Ομαδοποιημένες πολυγονιδιακές οικογένειες Μονήρεις ομάδες Παραδείγματα ομαδοποιημένων και διασκορπισμένων πολυγονιδιακών οικογενειών Οικογένεια Αρ. αντιγράφων Α. Ομαδοποιημένες πολυγονιδιακές οικογένειες   Μονήρεις ομάδες Αυξητική ορμόνη 5 α-σφαιρίνη 7 Βαριά αλυσίδα αντιγόνων ιστοσυμβατότητας τάξης Ι ~20 Πολλαπλές ομάδες ΗΟΧ 38 Ιστόνες 61 Υποδοχέας Olfactory ~1000 Β. Διασκορπισμένες πολυγονιδιακές οικογένειες Αλδολάση ΡΑΧ 9 NF1(Νευροϊνωμάτωση τύπου Ι) >12 Βαριά αλυσίδα φερριτίνης >15 Αφυδρογονάση 3-φωσφορικής γλυκεραλδεΰδης >18 Ακτίνη >20 Δύο τύποι οργάνωσης: Ομαδοποιημένες και διασκορπισμένες οικογένειες. Ωστόσο μερικές οικογένειες αποτελούνται από πολλαπλές ομάδες γονιδίων σε διαφορετικές χρωμοσωμικές θέσεις.

Οργάνωση (1) - Μονήρεις ομάδες Ταυτόσημης οργάνωσης. Υψηλή συσχέτιση γονιδίων σε ακολουθία και λειτουργία (π.χ. rRNA). Στενής ομαδοποίησης. Πιο απομακρυσμένα από τα προηγούμενα, αλλά υπόκεινται σε κοινούς ρυθμιστικούς μηχανισμούς. Υψηλός βαθμός δομικής και λειτουργικής ομοιότητας. Σύνθετες ομάδες. Λιγότερο στενή σχέση, πιθανόν να περιλαμβάνουν και άσχετα γονίδια.

Οργάνωση (2) - Πολλαπλές ομάδες Ομάδες υψηλής ομοιότητας. Ομάδες χαμηλής ομοιότητας. Ομάδες υψηλής ομοιότητας. ιστόνες Ομάδες χαμηλής ομοιότητας. Σφαιρίνες, ανοσοσφαιρίνες

Οργάνωση (3) – Διασκορπισμένες οικογένειες Προερχόμενες από δύο γονιδιώματα. Μεταφορά μιτοχονδριακών γονιδίων στον πυρήνα κατά την εξέλιξη. Προερχόμενες από αρχαίους γονιδιωματικούς ή γονιδιακούς διπλασιασμούς σε μακρά περίοδο εξελικτικού χρόνου. Λίγα μέλη, συνήθως ενεργά. Προερχόμενες από γεγονότα ρετρομετάθεσης. Συνήθως μη λειτουργικά γονίδια. family members are dispersed as solitary genes at two or more different chromosomal locations. The family members may show considerable sequence divergence unless their dispersion has been a relatively recent event, or there has been considerable selection pressure to maintain sequence conservation. Προερχόμενες από δύο γονιδιώματα. Μεταφορά μιτοχονδριακών γονιδίων στον πυρήνα κατά την εξέλιξη. Π.χ. ύπαρξη ισομορφών ενζύμων για πυρήνα και μιτοχόνδρια. Προερχόμενες από αρχαίους γονιδιωματικούς ή γονιδιακούς διπλασιασμούς σε μακρά περίοδο εξελικτικού χρόνου. Λίγα μέλη. Typically, all or most of the genes are functional, and may individually encode highly related products. Προερχόμενες από γεγονότα ρετρομετάθεσης. Σχετικά πρόσφατα γεγονότα αντίστροφης μεταγραφής RNA σε cDNA και ενσωμάτωση σε διαφορετική θέση. Συνήθως μη λειτουργικά.

Μέλη Πολυγονιδιακών Οικογενειών Λειτουργικά γονίδια Ψευδογονίδια Μη επεξεργασμένα Επεξεργασμένα Γονιδιακά θραύσματα Μη επεξεργασμένα ψευδογονίδια Ελαττωματικά αντίγραφα γονιδίων στο επίπεδο του γενωμικού DNA. Περιέχουν εξώνια, εσώνια και περιοχή υποκινητή των λειτουργικών γονιδίων. Γονιδιακά θραύσματα Αντίγραφα γονιδίων με έλλειψη μεγάλων ή μικρών τμηματων, ή μικρά θραύσματα, ακόμη και ένα μόνο εξώνιο. Επεξεργασμένα ψευδογονίδια Ελαττωματικά αντίγραφα γονιδίων στο επίπεδο του cDNA. Κυτταρικές αντίστροφες μεταγραφάσες μεταγράφουν το mRNA σε φυσικό cDNA το οποίο ενσωματώνεται στα χρωμοσώματα σε σημεία προσωρινής θραύσης.

Εξέλιξη Γονιδιακός διπλασιασμός Ελαστικότητα φυσικής επιλογής Άνισος επιχιασμός μεταξύ ομόλογων χρωμοσωμάτων και μεταξύ αδελφών χρωματίδων Ελαστικότητα φυσικής επιλογής τυχαίες μεταλλαγές συσσωρεύονται στο ένα αντίγραφο, ενώ το άλλο εκτελεί την αρχική λειτουργία Δημιουργία Πολυγονιδιακών Οικογενειών: Διπλασιασμός γονιδίων Οριζόντια μεταφορά γονιδίων, συνηθέστερη στους προκαρυωτικούς De novo δημιουργία γονιδίων από μη κωδικές περιοχές, πολύ σπάνια, μικρά μετάγραφα άγνωστης λειτουργίας. Δημιουργία νέων γονιδίων μέσω ένωσης δύο διαφορετικών γονιδίων σε έναν μερικό διπλασιασμό.

Εξελικτική απόκλιση Συσσώρευση αδρανοποιητικών μεταλλαγών  ψευδογονίδιο Ενίοτε προκαλείται νέα, χρήσιμη λειτουργία  γονιδιακή απόκλιση Συσσώρευση αδρανοποιητικών μεταλλαγών, κυρίως πλαισιοτροποποιητικών ή πρώιμης λήξης (σπάνια αμινοξικές αντικαταστάσεις ή μεταλλαγές στον υποκινητή) οδηγεί στη μετατροπή του ενός αντιγράφου σε ψευδογονίδιο Ενίοτε τυχαίες μεταλλαγές προκαλεούν τη διαμιουργία μιας νέας, χρήσιμης για το κύτταρο λειτουργία. Σε αυτή την περίπτωση τα δυο γονίδια θα συσσωρεύουν μεταλλαγές με τον ίδιο τυθμό και θα αρχίσουν να αυξάνουν την απόκλισή τους με το χρόνο.

Συνεξέλιξη ή συμπτωτική εξέλιξη Διατήρηση ομοιότητας μεταξύ μελών Μηχανισμοί Άνισοι επιχιασμοί Γονιδιακή σύγκλιση Μεταλλαγή μπορεί να επεκταθεί σε όλα τα μέλη Διατήρηση ομοιότητας μεταξύ μελών, αλλά απόκλιση μεταξύ διαφορετικών ειδών Μηχανισμοί Άνισοι επιχιασμοί Γονιδιακή σύγκλιση (μπορεί να δημιουργηθούν και υβριδικά γονίδια)

gene families can arise from tandem duplications, as in the case of the HOX, hemoglobin,or from polyploidization events such as those presumed to have preceded the origin of vertebrates and many plant species

Γονιδιακή επέκταση και συστολή Επέκταση: αύξηση αριθμού μελών με διπλασιασμό προσφέρει αρμοστικό πλεονέκτημα μέσω ποικιλίας μορίων Ή γρήγορη σύνθεση ενός προϊόντος μέσω αυξημένου αριθμού αντιγράφων Συστολή: μείωση μεγέθους οικογένειας με ελλείψεις Παρατηρείται όταν δεν υπάρχει περιβαλλοντική πίεση για διατήρηση του αριθμού Η επέκταση προσφέρει πλεονεκτήματα σε περιπτώσεις που χρειάζεται αυξημένη σύνθεση προϊόντος ή αυξημένη ποικιλία μορίων (αρμοστικό πλεονέκτημα): ανοσοαπόκριση, μεταγραφή, μετάφραση, διακυτταρική επικοινωνία και μεταφορά, αναπαραγωγή, μεταβολισμός, χημειοϋποδοχείς κλπ Η συστολή είναι τυχαία (όπως όλοι οι μηχανισμοί) αλλά παρατηρείται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις όπου το περιβάλλον (ή η αλλαγή του τρόπου ζωής ενός είδους) δεν επιβάλλει πια τη διατήρηση ενός ή όλων των μελών μιας πολυγονιδιακής οικογένειας. Πχ. Υποδοχείς όσφρησης των θηλαστικών είναι μειωμένοι στον άνθρωπο σε σχέση με νυκτόβιους συγγενείς του, καθώς αυτοί εξαρτώνται περισσότερο στην όσφρηση Ή απώλεια γονιδίων σχετικών με την παραγωγή κάποιων αμινοξέων όταν αυτά προσλαμβάνονται από την τροφή

Μεταγραφική ρύθμιση Διαφορική έκφραση γονιδίων ανάλογα με το αναπτυξιακό στάδιο

Στοιχεία ρύθμισης μεταγραφής Υποκινητής (ΤΑΤΑ box κλπ) Ενισχυτής (δράση από απόσταση) Μονωτής (εμποδίζει την έκφραση) LCR ή Ρυθμιστική Περιοχή του Γενετικού Τόπου Αποτελούν θέσεις πρόσδεσης γενικών και ειδικών μεταγραφικών παραγόντων (συνδυαστική ρύθμιση)

LCR (Locus Control Region) Υπερευαίσθητες στη DNase I θέσεις (χωρίς νουκλεοσώματα) Ιστοειδική και εξαρτώμενη από τον αριθμό γονιδίων ενίσχυση της έκφρασης Δράση από απόσταση (μοντέλο θηλειάς) Περιέχει πολλαπλές θέσεις πρόσδεσης ρυθμιστικών παραγόντων Μεγάλο μήκος, βρίσκεται πριν ή μετά τα γονίδια που ελέγχει Χαρακτηριστικό παράδειγμα η οικογένεια των β-σφαιρινών, αλλά έχει βρεθεί και σε άλλες οικογένειες

A model proposing how complexes form and interact at the mouse a globin locus during erythropoiesis. In committed erythroid progenitors (U-MEL, proerythroblast stage), the remote regulatory sequences (HS-31, HS-26, HS-12 and HS-8) are bound by multiprotein complexes containing various combinations of SCL, NF-E2 and GATA1. At this stage, the a globin promoter is also occupied by GATA1 in combination with the ubiquitous transcription factors ZBP-89 and NFY and is best poised for expression. In differentiating erythroid cells (IMEL and primary erythroblasts), the PIC, including Pol II, is recruited to the enhancers in a cooperative manner, but independently of the promoter. Sp/X-Kruppel-like transcription factors (e.g. Sp1 and Sp3) are also recruited independently of the upstream elements, to the promoter. At this final stage, the a globin promoter is now occupied by a multiprotein complex including GATA1, ZBP-89, EKLF, NFY, Sp1 and Sp3 that represents a docking site for the recruitment of PIC, which is entirely dependent on the presence of the upstream elements.

Τρόπος Λειτουργίας LCR Η μεταγραφή των υπόλοιπων γονιδίων καταστέλλεται Συνήθως γονίδια πλησιέστερα στον LCR εκφράζονται πρώτα Ειδικοί μεταγραφικοί παράγοντες που εκφράζονται σε συγκεκριμένα αναπτυξιακά στάδια επιτρέπουν την αλλαγή στην έκφραση, μειώνοντας τη σταθερότητα κάποιων συμπλόκων και ενισχύοντας τη σταθερότητα κάποιων άλλων. Η δημιουργία θηλιάς εξαρτάται από τη σταθερότητα μεταξύ των συμπλόκων που συνδέουν τον LCR με τις άλλες ρυθμιστικές θέσεις

Βιβλιογραφία Strachan, Tom and Read, Andrew P. (1999) «Human Molecular Genetics 2», Garland Science Brown, T.A. (2002) «Genomes», Garland Science Γ. Ροδάκης, Ρ. Λεκανίδου, Σ. Τσιτήλου «Ειδικά Κεφάλαια Μοριακής Βιολογίας» Jeffery P. Demuth, and Matthew W. Hahn (2009) «The life and death of gene families», BioEssays 31:29–39 Allan Force, Michael Lynch, F. Bryan Pickett, Angel Amores, Yi-lin Yan and John Postlethwait (1999) «Preservation of Duplicate Genes by Complementary, Degenerative Mutations», Genetics 151: 1531–1545 Tomoko Ohta (2000) «Evolution of gene families», Gene 259: 45–52 Masatoshi Nei and Alejandro P. Rooney «Concerted and Birth-and-Death Evolution of Multigene Families», Annu Rev Genet. 2005 ; 39: 121–152. Niall Dillon and Frank Grosveld «Transcriptional regulation of multigene loci: multilevel control» T1G April 1993 Vol. 9 No. 4 Douglas Vernimmen, Marco De Gobbi, Jacqueline A Sloane-Stanley, William G Wood and Douglas R Higgs «Long-range chromosomal interactions regulate the timing of the transition between poised and active gene expression», The EMBO Journal (2007) 26, 2041–2051. Karen E. Brown «Chromatin folding and gene expression: new tools to reveal the spatial organization of genes», Chromosome Research 11: 423^433, 2003. Peter Fraser and Frank Grosveld «Locus control regions, chromatin activation and transcription», Current Opinion in Cell Biology 1998, 10:361-365 http://www.bx.psu.edu/~ross/workmg/Isolat_analyz_genes_Chpt3.htm http://acgt.cs.tau.ac.il/hyden/HYDEN.htm