Φροντιστηριακές ασκήσεις στο κεφάλαιο των Πρωτεϊνών (Αμινοξέα, Πεπτίδια, Πρωτεΐνες) Στοιχεία από τη θεωρία απαραίτητα για την επίλυση ασκήσεων Υποδείγματα ασκήσεων (Μαθήματα Βιοχημείας, Εμ.Γ. Φραγκούλης, εκδ. Λίτσας) Π. Χ. Σκούρου, PhD

ΜΕΘΟΔΟΙ ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΥ 1. Βάσει του φορτίου Ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία Ηλεκτροφόρηση (συνήθως: σε ακρυλαμίδηπρωτεΐνες, σε αγαρόζη νουκλεϊκά οξέα) Ισοηλεκτρική εστίαση 2. Βάσει του μεγέθους Χρωματογραφία μοριακής διήθησης Ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS Υπερφυγοκέντρηση σε γραμμικά μεταβαλλόμενη κλίση σακχαρόζης 3. Άλλες Χρωματογραφία συγγένειας Χρωματογραφία υπό υψηλή πίεση

ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΤΗΛΗΣ Υλικά: 1.Γυάλινος σωλήνας με πολύ μεγαλύτερο μήκος από τη διάμετρό του 2.Πορώδης δίσκος (π.χ. βαμβάκι) στο ένα άκρο του σωλήνα 3.Ρητίνη Ιδιότητες της Ρητίνης: Αδρανές υλικό Μικρά σφαιρίδια Ιονιζόμενες ομάδες

ανιοντοανταλλάκτες: συνήθως diethylaminoethyl (DEAE)

κατιοντοανταλλάκτες: συνήθως carboxymethyl (CM)

ΟΜΑΔΕΣ ΠΟΥ ΔΕΣΜΕΥΟΝΤΑΙ ΤΥΠΟΣ ΡΗΤΙΝΗΣ ΣΤΑΘΕΡΗ ΦΑΣΗ ΟΜΑΔΕΣ ΠΟΥ ΔΕΣΜΕΥΟΝΤΑΙ Ανιοντοανταλλακτική (+) (-) Κατιοντοανταλλακτική Η ρητίνη επιλέγεται τέτοια ώστε να μπορεί η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει να προσδεθεί. Π.χ.: θετικά φορτισμένη πρωτεΐνη, επιλέγεται κατιοντοανταλλάκτης.

Το φορτίο της πρωτεΐνης καθορίζεται από το ισοηλεκτρικό της σημείο (pI) το οποίο μπορεί να προσδιοριστεί με ισοηλεκτρική εστίαση και προκύπτει ως συνισταμένη των φορτίων που διαθέτουν τα αμινοξέα που την αποτελούν. Όταν το pH του ρυθμιστικού διαλύματος είναι μεγαλύτερο του pI της πρωτεΐνης, τότε αυτή είναι αρνητικά φορτισμένη, και μάλιστα όσο μικρότερο το pI τόσο πιο αρνητικό το φορτίο της άρα συνδέεται πιο ισχυρά σε ανιοντοανταλλάκτη. Άρα: pH > pI .......... (-) pH < pI .......... (+)

Α. Έκλουση με διαβίβαση διαλύματος γραμμικά μεταβαλλόμενης κλίσης pH: Μεταβάλλεται το φορτίο των ουσιών που έχουν δεσμευθεί στον ιοντοανταλλάκτη και αυτές που χάνουν πιο εύκολα το φορτίο τους είναι αυτές που θα εκλουθούν πρώτες. είναι καλύτερο να μην αντιστρέφεται το φορτίο της πρωτεΐνης και να εκλούεται με ρυθμιστικό διάλυμα που έχει pH κοντά στο pI της πρωτεΐνης. Σε κατιοντοανταλλάκτη χρησιμοποιείται κλίση pH όξινοαλκαλικό Σε ανιοντοανταλλάκτη χρησιμοποιείται κλίση pH αλκαλικό  όξινο

ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑΤΑ Πρωτεΐνη με pI=7. Για να προσδεθεί σε ανιοντοανταλλάκτη πρέπει το pH>7 και για να γίνει η έκλουση πρέπει το pH του ρυθμιστικού διαλύματος να μειώνεται συνεχώς έως <7 Για να προσδεθεί σε κατιοντοανταλλάκτη πρέπει το pH<7 και για να γίνει η έκλουση πρέπει το pH του ρυθμιστικού διαλύματος να αυξάνεται συνεχώς έως >7 2. Μίγμα πρωτεϊνών ΑΒΓΔΕ με αντίστοιχα pIς 4, 5, 6, 7, 8 από το οποίο θέλουμε να απομονώσουμε την πρωτεΐνη Γ. Για να δεσμευθεί σε ανιοντοανταλλάκτη, πρέπει το ρυθμιστικό διάλυμα που θα χρησιμοποιηθεί να έχει pH>6. Έστω ότι χρησιμοποιείται ρυθμιστικό διάλυμα με pH=6,5. Οι πρωτεΐνες Α, Β, Γ θα δεσμευθούν στη στήλη. Για να γίνει η έκλουση θα χρησιμοποιηθεί ρυθμιστικό διάλυμα με pH<6 (ή διάλυμα υψηλής ιονικής ισχύος)

(σε κατιοντοανταλλάκτη) Β. Έκλουση με διαβίβαση ρυθμιστικού διαλύματος μεταβαλλόμενης ιονικής ισχύος: (εκλούονται πρώτα οι πρωτεΐνες που είναι ασθενέστερα συνδεδεμένες) ΠΑΡΑΔΕΙΓΜΑ (σε κατιοντοανταλλάκτη) Α/Α ΠΡΩΤΕΪΝΗ PI PH = 4,8 PH = 7,2 PH = 8 1 Καρβονική Ανυδράση 7,0 + 16,5 - 0,4 - 2,7 2 Καρβοξυπεπτιδάση Β 6,2 + 12 - 3,3 - 6,3 3 Χυμοθρυψίνη 8,0 + 9,0 + 2,7 0,0 (pI) 4 Λυσοζύμη 9,8 + 14,1 + 7,9 + 6,9 3-2-4-1 1,2 - 3-4 1,2,3 - 4

Να αντιστοιχίσετε τις ιδιότητες των πρωτεϊνών με τις κατάλληλες μεθόδους διαχωρισμού ΜΕΘΟΔΟΙ ΙΔΙΟΤΗΤΕΣ Ηλεκτροφόρηση Μοριακή διήθηση Ανοσοκατακρήμνιση Ισοηλεκτρική εστίαση Χρωματογραφία συγγένειας Ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία Υπερφυγοκέντριση Μέγεθος Φορτίο Ειδική δέσμευση

Μοριακό Βάρος Σειρά έκλουσης 16900 5 221600 2 13370 6 524800 1 23240 4 Προβλέψτε τη σειρά με την οποία θα εκλουθούν οι παρακάτω πρωτεΐνες από μοριακό διηθητή με περιοχή κλασμάτωσης από 5000 έως 400000 Πρωτεΐνη Μοριακό Βάρος Σειρά έκλουσης Μυογλοβίνη 16900 5 Καταλάση 221600 2 Κυτόχρωμα 13370 6 Μυοσίνη 524800 1 Χυμοθρυψινογόνο 23240 4 Αλβουμίνη Ορού 68500 3

3 1 2 4 5 Οι παρακάτω πρωτεΐνες για τις οποίες δίδονται τα ΜΒ και τα Ισοηλεκτρικά σημεία, διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS. Δώστε τη σειρά με την οποία θα κινηθούν από την κορυφή προς τη βάση ηλεκτροφόρηση παρουσία SDS.........  διαχωρισμός βάσει μεγέθους Πρωτεΐνες ΜΒ pI α-Αντιθρυψίνη 45000 5.4 Κυτόχρωμα 13400 10.6 Μυογλοβίνη 17000 7.0 Αλβουμίνη ορού 69000 4.8 Τρανσφερρίνη 90000 5.9 Σειρά μετακίνησης 3 1 2 4 5

Αν κάποιος θέλει να καθαρίσει με ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία ένα ένζυμο που έχει ως υπόστρωμα το DNA, τι είδους ρητίνη πρέπει να επιλέξει; Φωσφορικές ομάδες : αρνητικά φορτισμένες  DNA (υπόστρωμα) αρνητικά φορτισμένο Ένζυμο θετικά φορτισμένο  αρνητικά φορτισμένη ρητίνη  κατιοντοανταλλάκτης

Gly Ala Glu Lys Arg Ser - + Το παρακάτω μίγμα αμινοξέων ηλεκτροφορείται σε pH 6 Ποια θα κινηθούν ταχύτερα προς την άνοδο; Ποια θα κινηθούν ταχύτερα προς την κάθοδο; Ποια θα παραμείνουν στο / ή κοντά στο σημείο εκκίνησης; Gly Ala Glu Lys Arg Ser - + εκκίνηση άνοδος κάθοδος

Μίγμα αμινοξέων ηλεκτροφορείται σε pH 3,9 ΑΜΙΝΟΞΥ Pi Ala 6 Ser 5.7 Phe 5.5 Arg 10.8 Leu Asp 3 His 7.6 Φορτίο σε pH=3,9 Κίνηση προς: + -

- -- + - - + 2 1 6 5 3 4 ΑΜΙΝΟΞΥ Lys Arg Asp Glu Tyr Al Φορτίο σε Γράψτε τη σειρά έκλουσης των παρακάτω αμινοξέων που έχουν δεσμευθεί σε υψηλό pH σε μια ανιοντοανταλλακτική ρητίνη όταν σε αυτή διαβιβασθούν διαλύματα στα οποία γίνεται μείωση του pH. ανιοντοανταλλακτική ρητίνη (+) ΑΜΙΝΟΞΥ Lys Arg Asp Glu Tyr Al Φορτίο σε υψηλό pH - -- Φορτίο σε πιο χαμηλό pH + - Φορτίο σε χαμηλό pH - + Σειρά έκλουσης 2 1 6 5 3 4

ΠΕΠΤΙΔΙΑ Τα παρακάτω πεπτίδια δεσμεύονται σε ανιοντοανταλλάκτη. Με ποια σειρά θα εκλουσθούν σε γραμμικά μεταβαλλόμενη κλίση pH 101; ανιοντοανταλλακτική ρητίνη (+) ΠΕΠΤΙΔΙΑ Lys-Gly-Ala-Gly Lys-Gly-Ala-Glu His-Gly-Ala-Glu Glu-Gly-Ala-Glu Glu-Gly-Ala-Lys Φορτίο σε pH 10 - -- Φορτίο σε ενδιάμ.pH + - -- Φορτίο σε ενδιάμ.pH + - Φορτίο σε pH 1 + (-) Asp, Glu (+) Lys, His, Arg

Τα παρακάτω πεπτίδια ηλεκτροφορούνται με ηλεκτροφόρηση χαρτιού σε pH 1 Να προβλέψετε ποια θα κινηθούν προς την άνοδο (+), ποια προς την κάθοδο (-) και ποια θα παραμείνουν ακίνητα. ΠΕΠΤΙΔΙΑ Lys-Gly-Ala-Gly Lys-Gly-Ala-Glu His-Gly-Ala-Glu Glu-Gly-Ala-Glu Glu-Gly-Ala-Lys Φορτίο σε pH 1.9 +... Κ +...Κ Φορτίο σε pH 3 +...Κ Ο Φορτίο σε pH 6.5 +...Κ Ο -...Α Φορτίο σε pH 10 -...Α --...Α

Οι παρακάτω ανώμαλες αιμοσφαιρίνες βρέθηκε ότι είχαν τις εξής αλλαγές αμινοξέων σε σχέση με τη φυσική Hb: Όταν ηλεκτροφορηθούν σε pH 7, η ταχύτητά τους προς την άνοδο σε σύγκριση με τις κανονικές θα είναι αυξημένη ή ελαττωμένη; Α/Α Αιμοσφαιρίνη Θέση Κανονική Ανώμαλη 1 Hb I α 16 Lys Asp 2 Hb S b 6 Glu Val 3 Hb E b 26 4 Hb M b 67 Ταχύτητα Αυξημένη Ελαττωμένη

Πεπτίδιο έχει την παρακάτω δομή: Ala-Val-Lys-Leu-Phe-Arg-Cys-Tyr S | S Glu-Met-Lys-Val-Thr-Gly-Cys-Ala Τι κλάσματα παράγονται μετά από πέψη με θρυψίνη; Θρυψίνη: διασπά μετά από αργινίνη και λυσίνη Ala-Val-Lys Leu-Phe-Arg Cys-Tyr S | S Val-Thr-Gly-Cys-Ala Glu-Met-Lys Τι κλάσματα προκύπτουν μετά από αναγωγή και αλκυλίωση των δισουλφιδικών δεσμών και στη συνέχεια πέψη με θρυψίνη; Ala-Val-Lys Leu-Phe-Arg Cys-Tyr Glu-Met-Lys Val-Thr-Gly-Cys-Ala

Το οκταπεπτίδιο Ala-Val-Gly-Trp-Arg-Val-Lys-Ser υφίσταται πρωτεόλυση με θρυψίνη Α. Τι θα επιλέγατε ανάμεσα από χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής ή μοριακής διήθησης για τον κατάλληλο διαχωρισμό; Θρυψίνη: διασπά μετά από αργινίνη και λυσίνη. Πεπτίδια που προκύπτουν: Αla-Val-Gly-Trp-Arg, Val-Lys, Ser Έχουν διαφορετικό μέγεθος  μοριακή διήθηση β. ΄Εστω ότι το πεπτίδιο επωάζεται με χυμοθρυψίνη. Ποια θεωρείτε ως την καταλληλότερη μέθοδο για το διαχωρισμό; Χυμοθρυψίνη: διασπά μετά από αμινοξύ με πλευρική ομάδα με αρωματική ή αλειφατική ένωση (π.χ. Τρυπτοφάνη) Πεπτίδια που προκύπτουν: Ala-Val-Gly-Trp, Arg-Val-Lys-Ser Έχουν ίδιο μέγεθος αλλά διαφορετικό φορτίο (λόγω της αργινίνης)  ιοντοανταλλακτική χρωματογραφία

Ειδική ενεργότητα (Units/mg) Σε ένα συγκεκριμένο πρωτόκολλο καθαρισμού για μια πρωτεΐνη περιλαμβάνονται διαδοχικά τα στάδια που αναφέρονται στον πίνακα. Με βάση τα δεδομένα του πίνακα, να συμπληρωθούν οι στήλες που αναφέρονται στην ειδική ενεργότητα, τα επίπεδα καθαρισμού και την απόδοση. Ειδική ενεργότητα: ολική ενεργότητα / ολική πρωτεΐνη Επίπεδο καθαρισμού: ειδική ενεργότητα σταδίου καθαρισμού / ειδ.ενεργ. αρχικού εκχυλίσματος Απόδοση: ολική ενεργότητα σταδίου καθαρισμού / ολική ενεργότητα αρχικού εκχυλίσματος. Στάδιο καθαρισμού Ολική πρωτεΐνη (mg) Ολική ενεργότητα (Units) Ειδική ενεργότητα (Units/mg) Επίπεδα καθαρισμού Απόδοση % Αρχικό εκχύλισμα 20000 4000000 200 1 100 Κλασμάτωση με θειϊκό αμμώνιο 5000 3000000 600 3 75 Χρωματογραφία σε DEAE κυτταρίνη 1500 1000000 667 3,3 25 Χρωματογραφία μοριακής διήθησης 500 750000 7,5 19 Χρωματογραφία συγγενείας 45 675000 15000 17

Να δώσετε τη ρυθμιστική περιοχή ή τις ρυθμιστικές περιοχές των αμινοξέων Gly, His, Asp και Arg. Η ρυθμιστική περιοχή είναι το pK της ιονιζόμενης ή των ιονιζόμενων ομάδων±1: Gly: 1.3 – 3.3 & 8.6 – 10.6 His: 0.8 – 2.8 & 8.2 – 10.2 & 5 – 7 Asp: 1.1 – 3.1 & 8.8 – 10.8 & 2.9 – 4.9 Arg: 1.2 – 3.2 & 8 – 10 & 11.5 – 13.5 Να επιλέξετε ένα αμινοξύ που μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως ρυθμιστικό στο pH 4, pH 6, pH 9 και pH 12 pH 4: Asp pH 6: His pH 9: Gly, His, Arg pH 12: Arg pK: Gly=2.3&9.6, His=1.8&9.2&6, Asp=2.1&9.8&3.9, Arg=2.2&9.0&12.5