1 05-Χαρτογράφηση του γονιδιώματος

Το μέγιστο μήκος της αλληλουχίας του DNA που μπορεί να καθοριστεί με τις υπάρχουσες μεθόδους δεν ξεπερνάει ~1000 bp. Η αλληλουχία ενός μεγάλου μορίου DNA πρέπει να «συναρμολογηθεί». 2

3

4 Η ολοκληρωμένη αλληλουχία ενός τμήματος DNA προσδιορίζεται μέσω της συναρμολόγησης επικαλυπτόμενων αναγνώσεων αλληλουχίας.

Προβλήματα κατά τη στοίχιση / συναρμολόγηση των αλληλουχιών Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες; Επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες; Διαχείριση τεράστιου αριθμού αναγνώσεων; Διαχείριση τεράστιου αριθμού αναγνώσεων; 5

6

7

Στρατηγικές αλληλούχησης ολόκληρων γονιδιωμάτων 1. Μέθοδος των συνεχών κλώνων (clone contig method) 2. Τυχαία προσπέλαση (whole- genome shotgun method) 8

Figure 3.3 Genomes 3 (© Garland Science 2007) 9

Και με τις δύο μεθόδους, ο χάρτης είναι ένα βασικό συστατικό για την τελική χωροταξική συναρμολόγηση των αλληλουχιών που θα προκύψουν Και με τις δύο μεθόδους, ο χάρτης είναι ένα βασικό συστατικό για την τελική χωροταξική συναρμολόγηση των αλληλουχιών που θα προκύψουν 10

Γενετικοί και φυσικοί χάρτες Γενετική χαρτογράφηση: χάρτες σύνδεσης γονιδίων  σχετική θέση γονιδίων στα χρωμοσώματα Γενετική χαρτογράφηση: χάρτες σύνδεσης γονιδίων  σχετική θέση γονιδίων στα χρωμοσώματα Φυσική χαρτογράφηση: με τεχνικές μοριακής βιολογίας (in situ hybridization) καθορίζεται επακριβώς η φυσική θέση γονιδίων στα χρωμοσώματα Φυσική χαρτογράφηση: με τεχνικές μοριακής βιολογίας (in situ hybridization) καθορίζεται επακριβώς η φυσική θέση γονιδίων στα χρωμοσώματα 11

Γενετική χαρτογράφηση 12

«Γενετικοί δείκτες» : αλληλόμορφα με διακριτούς φαινότυπους «Γενετικοί δείκτες» : αλληλόμορφα με διακριτούς φαινότυπους Ψηλοί και κοντοί μίσχοι στα μοσχομπίζελα του Μέντελ Ψηλοί και κοντοί μίσχοι στα μοσχομπίζελα του Μέντελ Χρώμα οφθαλμών στις φρουτόμυγες. Μέχρι το 1922, από τα 50 χαρτογραφημένα γονίδια, τα 9 έλεγχαν χρώμα ματιών Χρώμα οφθαλμών στις φρουτόμυγες. Μέχρι το 1922, από τα 50 χαρτογραφημένα γονίδια, τα 9 έλεγχαν χρώμα ματιών Red, light red, vermilion, garnet, carnation, cinnabar, ruby, sepia, scarlet, pink, cardinal, claret, purple, brown Red, light red, vermilion, garnet, carnation, cinnabar, ruby, sepia, scarlet, pink, cardinal, claret, purple, brown 13

Τέτοιοι ορατοί χαρακτήρες ‘σκοράρονται’ με αναπόφευκτο υποκειμενισμό Τέτοιοι ορατοί χαρακτήρες ‘σκοράρονται’ με αναπόφευκτο υποκειμενισμό Ανάγκη να βρεθούν πιο ‘αντικειμενικοί’ δείκτες: Ανάγκη να βρεθούν πιο ‘αντικειμενικοί’ δείκτες: Βιοχημικοί δείκτες Βιοχημικοί δείκτες 14

DNA δείκτες για γενετική χαρτογράφηση Τα γονίδια είναι χρήσιμοι δείκτες αλλά: Τα γονίδια είναι χρήσιμοι δείκτες αλλά: Δεν καλύπτουν όλο το εύρος των χρωμοσωμάτων Δεν καλύπτουν όλο το εύρος των χρωμοσωμάτων Δεν έχουν πολλά (διακριτά) αλληλόμορφα Δεν έχουν πολλά (διακριτά) αλληλόμορφα Υπόκεινται σε επιλογικές δράσεις Υπόκεινται σε επιλογικές δράσεις DNA δείκτες DNA δείκτες RFLPs RFLPs SSLPs SSLPs SNPs SNPs 15

Πολυμορφισμοί Μήκους κλασμάτων περιορισμού: Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) 16

17

18

Πολυμορφισμοί μήκους απλής αλληλουχίας: Simple Sequence Length Polymorphisms (SSLP) Minisatellites Minisatellites Microsatellites / Simple Tandem Repeats (STRs) Microsatellites / Simple Tandem Repeats (STRs) 19

20

21

Πολυμορφισμοί μεμονωμένων νουκλεοτιδίων: Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) Πάνω από 4 εκατομμύρια στο ανθρώπινο γονιδίωμα Πάνω από 4 εκατομμύρια στο ανθρώπινο γονιδίωμα Δεν είναι όλα τα SNPs RFLPs, όμως πολλά είναι Δεν είναι όλα τα SNPs RFLPs, όμως πολλά είναι 22

Μέθοδοι τυποποίησης SNPs 23 Ειδικός υβριδισμός ολιγονουκλεοτιδίου

24 Ανίχνευση υβριδισμού μέσω αποχρωματισμού

Υβριδισμός με ολιγονουκλεοτίδιο με αταίριαστο νουκλεοτίδιο στο ένα άκρο 25

Δοκιμασία σύνδεσης ολιγονουκλεοτιδίων 26

Δοκιμασία ARMS 27

Στρατηγικές διαλογής SNPs που βασίζονται σε υβριδισμό ολιγονουκλεοτιδίων Στρατηγικές διαλογής SNPs που βασίζονται σε υβριδισμό ολιγονουκλεοτιδίων Τεχνολογία DNA chips Τεχνολογία DNA chips Τεχνική υβριδισμού διαλυμάτων Τεχνική υβριδισμού διαλυμάτων 28

Ανάδειξη υβριδισμού φθορίζοντος ανιχνευτή σε μικροσυστοιχία 29 DNA chip

Ανάλυση γενετικής σύνδεσης 30

31 Ο πρώτος νόμος του Μέντελ: τα αλληλόμορφα διαχωρίζονται τυχαία Ο πρώτος νόμος του Μέντελ: τα αλληλόμορφα διαχωρίζονται τυχαία Στη μονοϋβριδική διασταύρωση μιας ψηλής μπιζελιάς (Τ) με μια κοντή μπιζελιά (t), ο Μέντελ πήρε 787 ψηλούς και 277 κοντούς απογόνους (αναλογία 2,84:1). Δηλαδή, ο κάθε απόγονος έχει την ίδια πιθανότητα να κληρονομήσει είτε το Τ είτε το t αλληλόμορφο (όπως φαίνεται στο αβάκιο). Στη μονοϋβριδική διασταύρωση μιας ψηλής μπιζελιάς (Τ) με μια κοντή μπιζελιά (t), ο Μέντελ πήρε 787 ψηλούς και 277 κοντούς απογόνους (αναλογία 2,84:1). Δηλαδή, ο κάθε απόγονος έχει την ίδια πιθανότητα να κληρονομήσει είτε το Τ είτε το t αλληλόμορφο (όπως φαίνεται στο αβάκιο).

32 Ο δεύτερος νόμος του Μέντελ: τα ζεύγη των αλληλομόρφων διαχωρίζονται ανεξάρτητα Ο δεύτερος νόμος του Μέντελ: τα ζεύγη των αλληλομόρφων διαχωρίζονται ανεξάρτητα Στη διϋβριδική διασταύρωση μελετώνται δυο γονίδια. Το δεύτερο καθορίζει το σχήμα των μπιζελιών: στρογγυλά R ή ρυτιδωμένο r. Οι γονότυποι και οι φαινότυποι είναι εκείνοι που προβλέπονται από τον πρώτο και δεύτερο νόμο του Μέντελ, ο οποίο ορίζει ότι τα ζεύγη των αλληλομόρφων διαχωρίζονται ανεξάρτητα. Στη διϋβριδική διασταύρωση μελετώνται δυο γονίδια. Το δεύτερο καθορίζει το σχήμα των μπιζελιών: στρογγυλά R ή ρυτιδωμένο r. Οι γονότυποι και οι φαινότυποι είναι εκείνοι που προβλέπονται από τον πρώτο και δεύτερο νόμο του Μέντελ, ο οποίο ορίζει ότι τα ζεύγη των αλληλομόρφων διαχωρίζονται ανεξάρτητα.

Αν όμως τα γονίδια βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα; Αν όμως τα γονίδια βρίσκονται στο ίδιο χρωμόσωμα; Τα Α και Β θα έπρεπε να κληρονομούνται μαζί. Κατά συνέπεια, ο δεύτερος νόμος του Μέντελ δεν θα έπρεπε να ισχύει για την κληρονομική μεταβίβαση των Α και Β. Τα Α και Β θα έπρεπε να κληρονομούνται μαζί. Κατά συνέπεια, ο δεύτερος νόμος του Μέντελ δεν θα έπρεπε να ισχύει για την κληρονομική μεταβίβαση των Α και Β. Το C βρίσκεται σε διαφορετικό χρωμόσωμα, οπότε ο νόμος του Μέντελ θα πρέπει να ισχύει για τη μεταβίβαση των Α και C ή Β και C. Το C βρίσκεται σε διαφορετικό χρωμόσωμα, οπότε ο νόμος του Μέντελ θα πρέπει να ισχύει για τη μεταβίβαση των Α και C ή Β και C. O Μέντελ δεν ανακάλυψε τη σύνδεση γιατί καθένα από τα 7 γονίδια που μελέτησε ήταν σε διαφορετικά χρωμοσώματα. O Μέντελ δεν ανακάλυψε τη σύνδεση γιατί καθένα από τα 7 γονίδια που μελέτησε ήταν σε διαφορετικά χρωμοσώματα. 33

Μίτωση και μείωση 34

Τα συμβάντα σε ένα ζεύγος ομόλογων χρωμοσωμάτων κατά τη μείωση στα αναπαραγωγικά κύτταρα 35

Οι συνέπειες του επιχιασμού στα συνδεδεμένα γονίδια: 36 Αριστερά, χωρίς ανασυνδυασμό (γονικοί γαμέτες) Δεξιά με ανασυνδυασμό (δύο γονικοί και δύο ανασυνδυασμένοι γαμέτες) Αν εξετάζαμε το αποτέλεσμα της μείωσης σε 100 πανομοιότυπα κύτταρα και παίρναμε: 200AB 200 ab  Πλήρης σύνδεση Αν όμως συνέβαινε επιχιασμός σε 40 από τις 100 μειώσεις τότε θα παίρναμε: 160 AB 160 ab 40 Ab 40 aB  Μερική σύνδεση

Από τη μερική σύνδεση στη γενετική χαρτογράφηση στους ευκαρυώτες 37

Από τη συχνότητα ανασυνδυασμού συνάγουμε τις σχετικές θέσεις των γονιδίων πάνω σε ένα χρωμόσωμα 38

Όταν προγραμματισμένα πειράματα διασταυρώσεων είναι «ανήθικα» 39

Γενετική χαρτογράφηση στα βακτήρια Τα βακτήρια είναι απλοειδείς οργανισμοί και άρα δεν υπόκεινται σε μείωση Τα βακτήρια είναι απλοειδείς οργανισμοί και άρα δεν υπόκεινται σε μείωση 40 Πώς μπορεί να προκληθεί ανασυνδυασμός ώστε να μπορούν οι γενετιστές να πραγματοποιούν χαρτογραφήσεις; Πώς μπορεί να προκληθεί ανασυνδυασμός ώστε να μπορούν οι γενετιστές να πραγματοποιούν χαρτογραφήσεις;

Τρεις τρόποι μεταφοράς DNA μεταξύ βακτηρίων 41

Η βάση της χαρτογράφησης γονιδίων στα βακτήρια 42

Φυσική χαρτογράφηση 43

Η γενετική χαρτογράφηση δεν επαρκεί Η ανάλυση ενός γενετικού χάρτη εξαρτάται από τον αριθμό των επιχιασμών που καταγράφονται Η ανάλυση ενός γενετικού χάρτη εξαρτάται από τον αριθμό των επιχιασμών που καταγράφονται Δεν είναι πρόβλημα για μικροοργανισμούς (πχ E. coli, S. cerevisiae) Δεν είναι πρόβλημα για μικροοργανισμούς (πχ E. coli, S. cerevisiae) Είναι πρόβλημα για άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες Είναι πρόβλημα για άνθρωπο και άλλους ευκαρυώτες Οι γενετικοί χάρτες έχουν περιορισμένη ακρίβεια Οι γενετικοί χάρτες έχουν περιορισμένη ακρίβεια Hotspots, μη ομοιόμορφη κατανομή επιχιασμών Hotspots, μη ομοιόμορφη κατανομή επιχιασμών 44

Σύγκριση μεταξύ γενετικού και φυσικού χάρτη του χρωμοσώματος ΙΙΙ του Saccharomyces cerevisiae 45

1. Χαρτογράφηση περιορισμού (restriction mapping) 2. Φθορίζων υβριδισμός in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH) 3. Χαρτογράφηση με σημασμένες αλληλουχίες (sequence tagged site, STS, mapping) 46

1. Χαρτογράφηση περιορισμού Πολύ λίγες από τις θέσεις περιορισμού είναι πολυμορφικές  δεν χαρτογραφούνται πολλές θέσεις Πολύ λίγες από τις θέσεις περιορισμού είναι πολυμορφικές  δεν χαρτογραφούνται πολλές θέσεις Χαρτογράφηση μη πολυμορφικών θέσεων; Χαρτογράφηση μη πολυμορφικών θέσεων; 47

48

Ανάλυση μερικού περιορισμού με σήμανση στο άκρο του DNA 49

H χαρτογράφηση περιορισμού είναι εφικτή όταν: H χαρτογράφηση περιορισμού είναι εφικτή όταν: Υπάρχουν σχετικά λίγες θέσεις κοπής Υπάρχουν σχετικά λίγες θέσεις κοπής Το προς ανάλυση DNA είναι σχετικά μικρού μεγέθους Το προς ανάλυση DNA είναι σχετικά μικρού μεγέθους Λύσεις: «σπάνιοι κόφτες» Λύσεις: «σπάνιοι κόφτες» Ένζυμα που αναγνωρίζουν 7 ή 8 νουκλεοτίδια Ένζυμα που αναγνωρίζουν 7 ή 8 νουκλεοτίδια Ένζυμα που αναγνωρίζουν σπάνια μοτίβα (GC rich) Ένζυμα που αναγνωρίζουν σπάνια μοτίβα (GC rich) 50

Πώς διαχωρίζονται μεγάλα μόρια DNA; Το πρόβλημα: Το πρόβλημα: Όλα τα δίκλωνα DNA μόρια που είναι μεγαλύτερα από ~40kb μετακινούνται σε ένα πήκτωμα αγαρόζης όχι ανάλογα του μήκους τους αλλά ανάλογα του ηλεκτρικού πεδίου Όλα τα δίκλωνα DNA μόρια που είναι μεγαλύτερα από ~40kb μετακινούνται σε ένα πήκτωμα αγαρόζης όχι ανάλογα του μήκους τους αλλά ανάλογα του ηλεκτρικού πεδίου Άρα, τα μεγάλα DNA μόρια είναι αδύνατον να διαχωριστούν σε πηκτώματα αγαρόζης Άρα, τα μεγάλα DNA μόρια είναι αδύνατον να διαχωριστούν σε πηκτώματα αγαρόζης 51

52 Η λύση: Η λύση: Ηλεκτροφόρηση παλμικού πεδίου - Pulsed Field Gel Electrophoresis Ηλεκτροφόρηση παλμικού πεδίου - Pulsed Field Gel Electrophoresis Διαχωρισμός DNA μορίων ~5Mb Διαχωρισμός DNA μορίων ~5Mb Pulse time: από μερικά sec σε ώρες: Pulse time: από μερικά sec σε ώρες: όσο μεγαλύτερα τα DNA μόρια τόσο μεγαλύτερος "παλμός" χρειάζεται για το διαχωρισμό τους όσο μεγαλύτερα τα DNA μόρια τόσο μεγαλύτερος "παλμός" χρειάζεται για το διαχωρισμό τους

Οπτική χαρτογράφηση 53

Φθορίζων in situ υβριδισμός (FISH) 54

55

Sequence-Tagged Sites Ετικέτες μικρού μήκους χρησιμεύουν για τον προσδιορισμό του προσανατολισμού και της διαδοχικής σειράς γονιδιωματικών κλώνων Ετικέτες μικρού μήκους χρησιμεύουν για τον προσδιορισμό του προσανατολισμού και της διαδοχικής σειράς γονιδιωματικών κλώνων Ενώ ένα STS αντιπροσωπεύει ένα φυσικό τμήμα DNA μοναδικό στο γονιδίωμα, δεν χρειάζεται ένας κλώνος αλλά μπορεί να παραχθεί μέσω μιας PCR Ενώ ένα STS αντιπροσωπεύει ένα φυσικό τμήμα DNA μοναδικό στο γονιδίωμα, δεν χρειάζεται ένας κλώνος αλλά μπορεί να παραχθεί μέσω μιας PCR Η PCR είναι ταχύτερη και πιο εύχρηστη από το στύπωμα κατά Southern Η PCR είναι ταχύτερη και πιο εύχρηστη από το στύπωμα κατά Southern 56

57 Χαρτογράφηση με βάση την ανίχνευση STS σε κλώνους BAC.

Κοινές πηγές STSs Κοινές πηγές STSs Expressed Sequence Tags (ESTs) Expressed Sequence Tags (ESTs) Αλληλουχίες SSLPs Αλληλουχίες SSLPs Τυχαίες αλληλουχίες του γονιδιώματος Τυχαίες αλληλουχίες του γονιδιώματος 58

Χαρτογράφηση με υβρίδια ακτινοβολημένων κυττάρων 1990: Οι Cox και Myers βελτίωσαν μια παλιά (Goss and Harris, 1975) μέθοδο δημιουργίας υβριδίων κυττάρων τρωκτικών και ανθρώπου 1990: Οι Cox και Myers βελτίωσαν μια παλιά (Goss and Harris, 1975) μέθοδο δημιουργίας υβριδίων κυττάρων τρωκτικών και ανθρώπου 59

60 Παραγωγή σειρών υβριδίων ακτινοβολημένων κυττάρων με σκοπό τη χαρτογράφηση του γονιδιώματος. Οι Goss & Harris δημιούργησαν υβριδικά κύτταρα με πολύ μικρά τμήματα ανθρώπινων χρωμοσωμάτων (ισχυρές δόσεις ακτίνων Χ). Στη συνέχεια προκάλεσαν σύντηξη με κύτταρα τρωκτικών και απομόνωσαν κυτταρικές σειρές κάθε μία των οποίων είχε ένα μόνο τμήμα ανθρώπινου γονιδιώματος. Τέλος, έκαναν μελέτες σύνδεσης στα υβριδικά κύτταρα, προσδιορίζοντας τη συχνότητα με την οποία δύο γονίδια (ή δείκτες) συγκληρονομούνταν (βρίσκονταν μαζί σε ένα σετ υβριδίων).

Οι Cox και Meyers δημιούργησαν ένα σετ 90 ακτινοβολημένων υβριδίων Οι Cox και Meyers δημιούργησαν ένα σετ 90 ακτινοβολημένων υβριδίων Οι σειρές αυτές γονοτυπήθηκαν για την παρουσία ή απουσία χιλιάδων STSs Οι σειρές αυτές γονοτυπήθηκαν για την παρουσία ή απουσία χιλιάδων STSs Τα πρότυπα παρουσίας/απουσίας των STSs συγκρίθηκαν ώστε να προβλεφθεί η πιθανή σχετική διάταξη των STSs καθώς και η απόσταση μεταξύ τους Τα πρότυπα παρουσίας/απουσίας των STSs συγκρίθηκαν ώστε να προβλεφθεί η πιθανή σχετική διάταξη των STSs καθώς και η απόσταση μεταξύ τους 61

62 Εφαρμογή της χαρτογράφησης μέσω ανάλυσης υβριδίων ακτινοβολημένων κυττάρων (RH, Radiation Hybrid) για τον προσδιορισμό της διάταξης ετικετών θέσεων αλληλουχίας (STS, Sequence-Tagged Sites). Αν η εμφάνιση δυο STSs (πχ 1 και 19) σε πολλές κυτταρικές σειρές είναι πιο συχνή από ό,τι θα αναμενόταν τυχαία, δείχνει ότι αυτοί οι δύο δείκτες έχουν μικρή απόσταση μεταξύ τους.

Παρότι η διακριτική ικανότητα ενός τέτοιου χάρτη είναι χαμηλή, αποτελεί έναν ανεξάρτητο τρόπο προσδιορισμού της διάταξης τμημάτων DNA Παρότι η διακριτική ικανότητα ενός τέτοιου χάρτη είναι χαμηλή, αποτελεί έναν ανεξάρτητο τρόπο προσδιορισμού της διάταξης τμημάτων DNA 63 Σε κάθε περίπτωση: Σε κάθε περίπτωση: ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΤΕΧΝΙΚΩΝ ΣΥΝΔΥΑΣΜΟΣ ΤΕΧΝΙΚΩΝ

Brown, Κεφάλαιο 3 Brown, Κεφάλαιο 3 Watson, Κεφάλαιο 10 Watson, Κεφάλαιο 10 64