Ενόργανη Χημική Ανάλυση (Θ) Ενότητα 4: Εισαγωγή στις μεθόδους χρωματογραφίας Δρ. Αρχοντούλα Χατζηλαζάρου, Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Ενόργανης Ανάλυσης και Φυσικοχημείας Τμήμα Οινολογίας και Τεχνολογίας Ποτών Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Αθήνας Το περιεχόμενο του μαθήματος διατίθεται με άδεια Creative Commons εκτός και αν αναφέρεται διαφορετικά Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

Χρωματογραφία Η χρωματογραφία είναι μια τεχνική διαχωρισμού στην οποία το δείγμα τοποθετείται στην μία άκρη ενός υλικού προσρόφησης που ονομάζεται ακίνητη φάση. Στην συνέχεια αυτό εκλούεται (ξεπλένεται) από την κινητή φάση (έναν διαλύτη ή ένα αέριο) η οποία κινείται προς την άλλη άκρη της ακίνητης φάσης. Όσες ουσίες είναι πολύ διαλυτές στην κινητή φάση και προσροφώνται λίγο από την ακίνητη φάση "τρέχουν" πρώτες, ενώ όσες προσροφώνται ισχυρά κινούνται πιο αργά. Το αποτέλεσμα είναι ο διαχωρισμός τους. 1

Διαχωρισμός 1.Επιτυγχάνεται με διασπορά των συστατικών μεταξύ δύο φάσεων μιας κινητής και μιας στατικής. 2.Βασίζεται σε διαφορές στις φυσικοχημικές ιδιότητες των συστατικών του μίγματος, (πολικότητα, μέγεθος μορίων κ.λ.π.). 3.Η κινητή φάση διερχόμενη μέσα από τη στατική προκαλεί διαφορετική μετατόπιση πάνω σε αυτή των συστατικών του μίγματος τα οποία διαχωρίζονται μεταξύ τους εξερχόμενα από τη στήλη σε διαφορετικές χρονικές στιγμές. 2

Ανίχνευση Κατά την έξοδο από τη στήλη υπάρχει σύστημα ανίχνευσης Προσδιορισμός 1.Ποιοτικός προσδιορισμός (ταυτοποίηση) Επιτυγχάνεται με κριτήριο το χρόνο ανάσχεσης ή συγκράτησης. 2.Ποσοτικός προσδιορισμός Επιτυγχάνεται με κριτήριο το ύψος ή το εμβαδόν των κορυφών που καταγράφεται στον χρωματογράφο με τη βοήθεια του καταγραφικού οργάνου. 3

Ταξινόμηση χρωματογραφικών τεχνικών Με βάση τη φύση της κινητής και της στατικής φάσης o Υγροχρωματογραφία, o Αεριοχρωματογραφία. Με βάση το μηχανισμό διαχωρισμού o προσρόφηση, κατανομή, ιονανταλλαγή, o μοριακός αποκλεισμός. Με βάση τη φυσική μορφή της στατικής φάσης o χρωματογραφία στήλης ή επίπεδη. Με βάση τον τρόπο εισαγωγής και κινήσεως του δείγματος o μετωπική, εκτοπίσεως, εκλούσεως. 4

Είδη χρωματογραφίας Χρωματογραφία στήλης. Στην πρώτη στήλη το δείγμα μόλις έχει τοποθετηθεί. Στην δεύτερη μόλις έχει αρχίσει η έκλουση (και ο διαχωρισμός). Στην τρίτη ο διαχωρισμός είναι τέλειος. 5

Χρωματογραφία στήλης 1/3 Είναι η πρώτη ιστορικά χρωματογραφία που έγινε. Σ΄ αυτή, μία στήλη (σωλήνας) είναι γεμάτη με κατάλληλο για τον επιθυμητό διαχωρισμό προσροφητικό υλικό (τα συνηθέστερα είναι το οξείδιο πυριτίου και η αλουμίνα), τοποθετείται κάθετα. Στο άνω μέρος της στήλης τοποθετείται το δείγμα και ακολουθεί έκλουση: Κατάλληλα επιλεγμένος διαλύτης τοποθετείται στο πάνω μέρος της στήλης και όπως ρέει προς τα κάτω εκλούει το δείγμα. Έτσι μέσα στη στήλη γίνεται διαχωρισμός των συστατικών του δείγματος, τα οποία είναι ορατά σε χρωματιστές ζώνες (εξ αυτού και το όνομα χρωματογραφία), εφόσον βέβαια τα συστατικά είναι έγχρωμα. Αν δεν είναι έγχρωμα, ο διαχωρισμός είναι εξίσου καλός, αλλά επειδή δεν είναι ορατά με το μάτι χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές για να τα "δει" ο αναλυτής (π.χ. αν φθορίζουν στο υπεριώδες φως τα φωτίζει με τέτοιο, οπότε έχουμε φθορίζουσες ζώνες).οξείδιο πυριτίουαλουμίναφθορίζουσες 6

Χρωματογραφία στήλης 2/3 Εξέλιξη της χρωματογραφίας στήλης είναι η χρωματογραφία υψηλής πίεσης ή απόδοσης (HPLC - High pressure (performance) liquid chromatography), στην οποία χρησιμοποιείται ο ακόλουθος ηλεκτρονικός/μηχανολογικός εξοπλισμός: Μία αντλία πιέζει τον διαλύτη προς την στήλη (στην απλή χρωματογραφία, ο διαλύτης ρέει με την δύναμη της βαρύτητας) με πιέσεις τάξεως μερικών χιλιάδων psi. Το έκλουσμα περνά στην συνέχεια μέσα από ανιχνευτή, ο οποίος μετρά συνεχώς είτε τον δείκτη διαθλάσεως του υγρού, είτε την ειδική απορρόφηση (φασματοφωτόμετρο) είτε άλλο χαρακτηριστικό με άλλη διάταξη (φθορισμόμετρο, φασματοφωτόμετρο μάζας, αγωγιμόμετρο κλπ) το οποίο παρέχει ένα σήμα σε ένα καταγραφικό.δείκτη διαθλάσεωςφασματοφωτόμετρο αγωγιμόμετρο 7

Χρωματογραφία στήλης 3/3 Το καταγραφικό καταγράφει το σήμα (είτε απευθείας είτε μέσω υπολογιστή) με τη μορφή που υπάρχει στη σχετική απεικόνιση. Εξαιτίας της υψηλής πίεσης, η HPLC είναι ταχύτατη (παρέχει αποτέλεσμα σε μερικά λεπτά της ώρας) και επειδή χρησιμοποιούνται λεπτόκοκκα υλικά προσρόφησης (λίγα μικρόμετρα) έχει μεγάλη ικανότητα διαχωρισμού. 8

Χρωματογραφία χάρτου 1/3 Είναι η πιο απλή μορφή χρωματογραφίας. Στην άκρη από ένα κομμάτι χαρτί (ακίνητη φάση) τοποθετείται μια κηλίδα δείγματος. Το χαρτί βυθίζεται στον κατάλληλο διαλύτη (κινητή φάση) από την μεριά της κηλίδας, και όπως το χαρτί διαποτίζεται σιγά-σιγά από το διαλύτη, εκλούονται τα συστατικά του δείγματος και γίνεται διαχωρισμός. Εδώ μπορούν να εμφανιστούν "αόρατες" ουσίες που διαχωρίστηκαν με ψεκασμό (ή διαβροχή) με κατάλληλα αντιδραστήρια. Ο λόγος της απόστασης που διήνυσε η κάθε ουσία προς την απόσταση που διήνυσε ο διαλύτης (R f ), για κάθε σύστημα υλικού προσρόφησης-διαλύτη-θερμοκρασίας είναι φυσική σταθερά για την κάθε ουσία.φυσική σταθερά 9

Χρωματογραφία χάρτου 2/3 Παράδειγμα: Αν με διαλύτη εξάνιο -ισοπροπανόλη 5:1, ξηρό χαρτί Whatman No1 και θερμοκρασία 25 βαθμούς κελσίου μία ουσία έχει R f 0.55, αυτό σημαίνει ότι αν ο διαλύτης κινηθεί 10 εκατοστά, η ουσία θα μετακινηθεί 5,5 εκατοστά. Αν κινηθεί 20 εκατοστά, η ουσία θα μετακινηθεί 11 εκατοστά κ.ο.κ.εξάνιοισοπροπανόλη Δηλαδή αναπτύσσοντας ένα χρωματογράφημα, μπορούμε να εκτιμήσουμε και ποιές ουσίες είναι αυτές που διαχωρίστηκαν. 10

Χρωματογραφία χάρτου 3/3 Είναι σύνηθες επειδή ακριβώς μπορεί από πείραμα σε πείραμα κάποιες συνθήκες να διαφέρουν ελάχιστα (π.χ. το χαρτί να έχει απορροφήσει λίγη υγρασία, ή να έχει εξατμιστεί λίγο εξάνιο από τον διαλύτη, οπότε η αναλογία δεν είναι πια 5:1). Αυτό έχει μεγάλη επίδραση στο R f, αλλά παράλληλα με το δείγμα, στο ίδιο χαρτί, "τρέχουν" πρότυπες ουσίες (τοποθετείται μια κηλίδα τους δίπλα στην κηλίδα του δείγματος και μετά αναπτύσσεται το χρωματογράφημα). Μετά την ανάπτυξη, όσο έχει μετακινηθεί η πρότυπη ουσία, τόσο πρέπει να έχει μετακινηθεί και η μελετώμενη ουσία του δείγματος. Δηλ. ουσιαστικά προσδιορίζεται το R f για τις συνθήκες του συγκεκριμένου πειράματος. Βλέπε και σχετική φωτογραφία από χρωματογραφία λεπτής στιβάδας. 11

Χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC) Είναι ανάλογη της χρωματογραφίας χάρτου, αλλά αντ' αυτού χρησιμοποιείται λεπτή στιβάδα προσροφητικού υλικού που στηρίζεται πάνω σε λεία επιφάνεια (συνήθως οξείδιο πυριτίου ή αλουμίνα πάνω σε γυάλινη πλάκα ή πλάκα αλουμινίου).οξείδιο πυριτίουαλουμίνα Έχει πολύ καλύτερη ικανότητα διαχωρισμού από την χρωματογραφία χάρτου. Επίσης επιτρέπει την εμφάνιση "αόρατων" ουσιών με πολύ πιο έντονα μέσα (π.χ. διαβροχή με θειικό οξύ - κάτι που θα κατέστρεφε το χαρτί).θειικό οξύ 12

Αέριος χρωματογραφία (GC) Σε αυτήν η κινητή φάση είναι αέριο και η όλη οργανολογία είναι αρκετά πολύπλοκη (η μέθοδος επεξηγείται αναλυτικά σε επόμενη ενότητα). Πετυχαίνει πάρα πολύ καλούς διαχωρισμούς. Η ικανότητα ανίχνευσης των αναλυόμενων συστατικών είναι πολύ μεγάλη 13

Τέλος Ενότητας

Σημειώματα

Σημείωμα Αναφοράς Copyright Τεχνολογικό Εκπαιδευτικό Ίδρυμα Αθήνας, Αρχοντούλα Χατζηλαζάρου Αρχοντούλα Χατζηλαζάρου. «Ενόργανη Χημική Ανάλυση (Θ). Ενότητα 4: Εισαγωγή στις μεθόδους χρωματογραφίας». Έκδοση: 1.0. Αθήνα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση: ocp.teiath.gr.ocp.teiath.gr

Σημείωμα Αδειοδότησης Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά, Μη Εμπορική Χρήση Παρόμοια Διανομή 4.0 [1] ή μεταγενέστερη, Διεθνής Έκδοση. Εξαιρούνται τα αυτοτελή έργα τρίτων π.χ. φωτογραφίες, διαγράμματα κ.λ.π., τα οποία εμπεριέχονται σε αυτό. Οι όροι χρήσης των έργων τρίτων επεξηγούνται στη διαφάνεια «Επεξήγηση όρων χρήσης έργων τρίτων». Τα έργα για τα οποία έχει ζητηθεί και δοθεί άδεια αναφέρονται στο «Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων». [1] Ως Μη Εμπορική ορίζεται η χρήση: που δεν περιλαμβάνει άμεσο ή έμμεσο οικονομικό όφελος από την χρήση του έργου, για το διανομέα του έργου και αδειοδόχο που δεν περιλαμβάνει οικονομική συναλλαγή ως προϋπόθεση για τη χρήση ή πρόσβαση στο έργο που δεν προσπορίζει στο διανομέα του έργου και αδειοδόχο έμμεσο οικονομικό όφελος (π.χ. διαφημίσεις) από την προβολή του έργου σε διαδικτυακό τόπο Ο δικαιούχος μπορεί να παρέχει στον αδειοδόχο ξεχωριστή άδεια να χρησιμοποιεί το έργο για εμπορική χρήση, εφόσον αυτό του ζητηθεί.

Επεξήγηση όρων χρήσης έργων τρίτων Δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου, παρά μόνο εάν ζητηθεί εκ νέου άδεια από το δημιουργό. © διαθέσιμο με άδεια CC-BY διαθέσιμο με άδεια CC-BY-SA διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC-SA διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου και η δημιουργία παραγώγων αυτού με απλή αναφορά του δημιουργού. Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού, και διάθεση του έργου ή του παράγωγου αυτού με την ίδια άδεια. Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου. Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. και διάθεση του έργου ή του παράγωγου αυτού με την ίδια άδεια Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-ND Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η δημιουργία παραγώγων του έργου. διαθέσιμο με άδεια CC-BY-NC-ND Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου με αναφορά του δημιουργού. Δεν επιτρέπεται η εμπορική χρήση του έργου και η δημιουργία παραγώγων του. διαθέσιμο με άδεια CC0 Public Domain διαθέσιμο ως κοινό κτήμα Επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου, η δημιουργία παραγώγων αυτού και η εμπορική του χρήση, χωρίς αναφορά του δημιουργού. χωρίς σήμανσηΣυνήθως δεν επιτρέπεται η επαναχρησιμοποίηση του έργου.

Διατήρηση Σημειωμάτων Οποιαδήποτε αναπαραγωγή ή διασκευή του υλικού θα πρέπει να συμπεριλαμβάνει:  το Σημείωμα Αναφοράς  το Σημείωμα Αδειοδότησης  τη δήλωση Διατήρησης Σημειωμάτων  το Σημείωμα Χρήσης Έργων Τρίτων (εφόσον υπάρχει) μαζί με τους συνοδευόμενους υπερσυνδέσμους.

Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στo πλαίσιo του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο ΤΕΙ Αθηνών» έχει χρηματοδοτήσει μόνο την αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.