Επιστημονικός Συνεργάτης Δρ. Περικλής Διαμαντόπουλος ΑΡΧΕΣ ΓΕΩΡΓΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

Γενικές A ρχές Βιοτεχνολογίας ΚΕΝΤΡΙΚΟ ΔΟΓΜΑ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ DNA  RNA  ΠΡΩΤΕΪΝΗ Όλοι οι ζώντες οργανισμοί διέπονται από βιοχημικές αντιδράσεις και τα μόρια που τις καταλύουν είναι οι πρωτεϊνες. Η βιοχημεία είναι η επιστήμη που μελετά τη δομή και τη λειτουργικότητα των βιομορίων αυτών. Η μοριακή βιολογία με την απομόνωση γονιδίων προσδιορίζει τη λειτουργία αυτών μέσω της έκφρασης αυτών. Η σύστασή τους προσδίδει τελείως διαφορετικές φυσικοχημικές ιδιότητες. Η δομή τους που εξαρτάται από την αλληλουχία των αμινοξέων μπορεί να αναγνωριστεί σαν « ξένη » σε άλλα βιολογικά συστήματα, έτσι ώστε να είναι δυνατή η παραγωγή αντισωμάτων πολύ εξειδικευμένων ως προς μια συγκεκριμένη πρωτεϊνη ( πολυκλωνικά ) ή κύριο επιτόπιο πρωτεϊνης ( μονοκλωνικα αντισώματα ).

Γενικές Αρχές Βιοτεχνολογίας Τα γονίδια αποτελούνται από 4 μόνο διαφορετικές βάσεις (A, G, C, T). Ένα γονίδιο μπορεί να περιέχει 4500 βάσεις γονιδιώματος. Γονιδιακοί χειρισμοί - Είναι η εισαγωγή, τροποποίηση, απάλειψη τμημάτων DNA ή RNA. - Αυτό γίνεται με τη βοήθεια κάποιου πλασμιδίου ή ιού ή οποιουδήποτε μορίου ( π. χ. ζύμης ). - Η προκύπτουσα δόμηση επιτρέπει την ενσωμάτωση μέσα στον οργανισμό « ξενιστή » στον οποίο δύναται να πολλαπλασιάζεται και να μεταβιβάζεται στην επόμενη γενιά. - Κλωνοποίηση είναι ο πολ / σμος ενός τμήματος DNA μέσα στον ίδιο ή διαφορετικό ξενιστή και η μεταβίβασή του στην επόμενη γενιά.

Γενικές Αρχές Βιοτεχνολογίας Το πρώτο βήμα είναι η απομόνωση, ο χαρακτηρισμός και η ανάλυση τμήματος του γονιδιώματος ή cDNA. Μπορούν να τατοποιηθούν τμήματα του DNA που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων τοπικά και χρονικά. ORFs Ανακάλυψη των π. ε./ ένωση τμημάτων DNA με λιγάση Φορέας Κλωνοποίησης : Το πλασμίδιο είναι αυτόνομο εξωχρωμοσωμικό στοιχείο προκαρυωτικής προέλευσης και κυκλικής διαμόρφωσης. Έχει τρεις χαρακτηριστικές ιδιότητες - Την αρχή αντιγαφής - Ένα γονίδιο - μάρτυρα για επιλογή ( συνήθως ανθεκτικότητα σε κάποιο αντιβιοτικό ) - Ορισμένες θέσεις π. ε. που απαντώνται μόνο μια φορά.

Γονιδιωματική ή cDNA βιβλιοθήκη Γ. Β. είναι το σύνολο των τμημάτων DNA του γονιδιώματος που έχουν κλωνοποιηθεί σε φορείς ( π. χ. πλασμίδια ή βακτηριοφάγους ) cDNA B. αναφερόμαστε στο σύνολο των εκφραζομένων γονιδίων που έχουν κλωνοποιηθεί σε φορείς με ανεξάρτητες ενθέσεις και υπάρχουν σε διακριτές οντότητες. Η cDNA B. εξαρτάται από το status quo των κυττάρων του ιστού που έχει προέλθει και έτσι είναι διαφορετική αν έχει προέλθει από ρίζα από φύλλα του ίδιυ φυτού. Πολλές φορές εξαρτάται και από το αναπτυξιακό στάδιο του ιστού ή οργάνου. Η cDNA B. Περιέχει μόνο γονίδια που εκφράζονται, ώριμα mRNA, στα οποία έχει γίνει συρραφή και εξαγωγή των ιντρονίων. Άρα μια cDNA βιβλιοθήκη περιέχει μόνο κωδικές περιοχές εξωνίων ( αλληλουχίες του DNA του γονιδίου που κωδικοποιούν αμινοξέα ).

Γενετικός Μετασχηματισμός των φυτών.

Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens (updated scientific name: Rhizobium radiobacter) [2][3] is the causal agent of crown gall disease (the formation of tumours) in over 140 species of dicot. It is a rod shaped, Gram negative soil bacterium. [1] Sy mptoms are caused by the insertion of a small segment of DNA (known as the T-DNA, for 'transfer DNA'), from a plasmid, into the plant cell, [4] which is incorporated at a semi-random location into the plant genome. [2][3]tumoursdicotGram negativebacterium [1]DNAT-DNA [4]genome

Α. Tumefaciens… Ι n order to be virulent, the bacterium must contain a tumour-inducing plasmid (Ti plasmid or pTi), of 200 kb, which contains the T-DNA and all the genes necessary to transfer it to the plant cell. Many strains of A. tumefaciens do not contain a pTi.virulenttumour-inducing plasmidkbgenes In the presence of opines, A. tumefaciens produces a diffusible conjugation signal called 30C8HSL or the Agrobacterium autoinducer. This activates the transcription factor TraR, positively regulating the transcription of genes required for conjugation.opinestranscription factortranscription

Genetic Transformation

Χρήσιμες ιδιότητες του A.tumefaciens Για τη μελέτη της βιολογίας του φυτού καθώς και για την τροποποίηση των ιδιοτήτων του φυτού έχουν αναπτυχθεί τεχνολογίες για το γενετικό μετασχηματισμό των φυτών μέσω ενός παθογόνου βακτηρίου του A. tumefaciens. Έχει την ικανότητα να μεταφέρει τμήμα του δικού του DNA ( του Τ -DNA) στο πυρηνικό γονιδίωμα των φυτικών κυττάρων. Η δημιουργία του κορωνοτού κάλλου διαμορφώνεται εξαιτίας ορισμένων γονιδίων του Agrobacterium που μεταφέρονται στο φυτό. Η κατανόηση της βιολογικής αυτής διεργασίας θα μπορούσε να δώσει τα πρώτα μηνύματα της χρησιμοποίησης του συστήματος για την τεχνολογία του αν / μενου DNA στα φυτά και τη δημιουργία διαγονιδιακών φυτών.

Μολυσματικότητα και Κορωνωτός κάλλος Τα τοξικά στελέχη του A. tumefaciens περιέχουν ένα μεγάλο εξωχρωμοσωμικό στοιχείο, στο οποίο εδράζονται τα γονίδια που εμπλέκονται στην επαγωγή του κορωνωτού κάλλου. Το εξωχρωμοσωμικό στοιχείο είναι ένα πλασμίδιο με εξαιρετικά μεγάλο μέγεθος 200kb. E ξαιτίας του ρόλου του στην επαγωγή του κορονωτού κάλλου το πλασμίδιο αυτό ονομάζεται Ti, ογκοεπαγωγικό πλασμίδιο. Η τοξικότητα των Agrobacterium χάνεται όταν τα πλασμίδια αυτά αποβάλλονται από τα βακτήρια, απλά με την επώαση στους 37 ο αντί στους 28 ο, που είναι η άριστη θερμοκρασία ανάπτυξης των βακτηρίων αυτών. Ο κορονωτός κάλλος είναι η ασθένεια των φυτών που προκύπτει από τη μολυσματικότητα των Agrobacterium.

Το πλασμίδιο pTiC58 Διαγραμματική απεικόνιση του πλασμιδίου pTiC58 που προέρχεται από το στέλεχος A.tumefaciens C58. Ori: περιοχή του πλασμιδίου υπεύθυνη για την αντιγραφή, Vir: στην περιοχή αυτή εδράζουν τα γονίδια τοξικότητας. Con: γονιδιακές περιοχές που προσδίδουν τη συζευκτική δραστηριότητα του πλασμιδίου.