Metode određivanja HDL-H i LDL-H Seminarski rad: Metode određivanja HDL-H i LDL-H Ivana Radovanović Mentor: Prof.V.Spasojević-Kalimanovska

HDL-holesterol lipoprotein velike gustine koji sadrži 50 % apolipoproteina i to uglavnom apo AI i apo AII, fosfolipide i holesterol heterogene čestice, oko 14 subklasa polidisperzne, svaka subklasa sadrži različit odnos lipida i protena antiaterogena, kardioprotektivna uloga

Metode određivanja HDL-H NE POSTOJI DEFINITIVNA METODA ZA ODREĐIVANJE HDL-H! 1. CDC Referentna metoda – nije zvanično akreditovana: koristi ultracentrifugranje i polianjonsku precipitaciju kako bi se pripremila frakcija koja sadrži HDL-H ultracentrifugiranjem se uklanjaju hilomikroni i VLDL- izdvajaju se na vrhu epruvete u sloju ispod izdvajaju se IDL, LDL, Lp(a) koji se precipitiraju sa heparinom i MnCl2 precipitat se uklanja centrifugiranjem na maloj brzini dobija se supernatant u kome se nalazi HDL-H koji se određuje CDC RM za holesterol

CDC referentna metoda za holesterol Hemijska hidroliza hol.estara sa alkoholnim KOH Ekstrakcija slobodnog holesterola sa heksanom Obojena Liebermann-Burchard reakcija (anhidrid sirćetne kiseline/sirćetna kiselina/sumporna kiselina-L-B reagens) Nastali hromogen se meri na 620nm

2. DCM (Designeted Comparasion Metod) Razvijena i validovana od strane CRMLN (Cholesterol Reference Method Laboratory Network ) rezultati ekvivalentni CDC RM bez ultracentrifugiranja ( skupa metoda ) modifikovana dekstran sulfat (50 000 Da) precipitaciona metoda CRMLN je uveo DCM metodu poređenja kako bi se izbeglo ultracentrifugiranje koje je skupo i zahteva veliku zapreminu uzorka.

3. Precipitacione metode određivanje HDL-H u supernatantu, nakon precipitacije apoB-100 lipoproteinskih čestica (VLDL, IDL, Lp(a) i hilomikrona) upotrebom polianjona i dvovalentnih katjona najpre usvojena kombinacija precipitirajućih agenasa je heparin/MnCl2 (ustanovljeno da zaostali Mn može da interferira, dajući lažno više rezultate) alternativni precipitirajući agensi: - dekstransulfat ( 50 000 Da) / MgCl2 (USA) - fosfovolframova kiselina / MgCl2 i PEG (Evropa)

Nedostaci: Uzorci sa visokim sadržajem TG mogu dovesti do zamućenja supernatanta. U ovom slučaju vrše se neki od sl.postupaka: -ultracentrifufiranje i odvajanje plivajućeg sloja -dvostruka dilucija izotonom -propuštanje supernatanta kroz guste filtre -nove precipitacione metode uvode magnetne kuglice u kompleksu sa dekstran sulfatom i Mg2+

4.Homogene (direktne) metode Princip metode: Hemijsko ili imunološko blokiranje non-HDL čestica bez precipitacije i određivanje HDL-H enzimskom metodom direktnim mešanjem reagensa sa serumom. I homogena metoda (Internatinal Reagents Corp., Kobe, Japan) 4 reagensa koji se sukcesivno dodaju: -PEG (agregacija hilomikrona, VLDL, LDL) -At koja blokiraju non-HDL čestice -mešavina enzima CH-esteraze, oksidaze i peroksidaze -soli guanidina koje zaustavljaju bojenu reakciju

II homogena metoda (Kyowa Medex Co II homogena metoda (Kyowa Medex Co., Tokyo, Japan; Roche Diagnostics, Indianapolis,Ind) 2 reagensa - alfa ciklodekstran sulfat/Mg2+ - PEG + CH-esteraza i CH-oksidaza III homogena metoda (Daichi Pure Chemicals Co., Tokyo/Genzyme Corp., Cambridge, Mass) - sintetski polimeri i polianjoni - deterdženti, enzimi i supstrati

IV homogena metoda (Wako Pure Chemicals Industry, Osaka, Japan) 2 reagensa - At na humani apo B-100 - enzimi V homogena metoda (Denka Seiken Co., Niigata, Japan/Polymedico Inc., Cortlandt Manor, NY/Randox Laboratories Limited, Crumlin, UK) - CH-esteraza i CH-oksidaza, katalaza - inhibitor katalaze i surfaktant

Prednosti: potpuno automatizovane ne zahtevaju preanalitičku obradu uzorka potrebna je manja zapremina uzorka Nedostaci: netačni rezultati u uzorcima sa dslipidemijom, naročito kod tip III hiperlipidemija nisu sve metode standardizovane i validovane prema CDC RM i DCM

LDL-holesterol lipoproteini niske gustine (1.006-1.063kg/L) koji sadrže trigliceride, holesterol 45%, fosfolipide i apo B-100 heterogena i polidisperzna populacija čestica visok aterogeni potencijal

Medode određivanja LDL-H NE POSTOJI DEFINITIVNA METODA ZA ODREĐIVANJE LDL-H! Indirektne metode zasnivaju se na merenju brojnih lipidnih parametara u uzorku i iz tako određenih lipidnih parametara izračunava se koncentracija LDL-H. U ove metode spada izračunavanje na osnovu Friedwaldove formule i beta kvantifikacije

1. Friedwald-ova formula najviše korišćena indirektna metoda holesterol, TG i HDL-H se kvantitativno mere a LDL-H se izračunava korišćenjem empirijski izvedene formule od strane Friedwalda i kolega [LDL-H] = [ukupan holesterol] – [HDL-H] – [TG/5] TG/5 - ako su vrednosti date u mg/dL TG/2,22 - ako su vrednosti date u mmol/L i ovaj faktor podrazumeva konc.holesterola u VLDL čestici.

Nedostaci Friedewald-ove formule: pouzdanost formule opada sa porastom Tg oboljenja jetre povećavaju sadržaj Tg u LDL i HDL a smanjuju u VLDL; izračunati VLDL-H lažno povišen a LDL-H lažno snižen hormonska terapija kod postmenopauzalnih žena: Friedewald vs BQ daje za 2-4 mg/L niže vrednosti LDL-H Formula ne treba da se koristi u slučaju: prisustva hilomikrona TG ≥ 4.52 mmol/L (LDL-H se određuje direktnom metodom) Tip III hiperlipoproteinemije

2.Beta kvantifikacija kombinuje preparativno ultracentrifugiranje i polianjonsku precipitaciju prva faza je ultracentrifugiranje na 105000g 18h na 10C pri gustini od 1,006g/mL VLDL i hilomikroni se akumuliraju u gornjem plivajućem sloju i uklanjaju se pipetiranjem LDL i HDL se nalaze u donjem sloju koji se promeša i dopuni na prvobitnu zapreminu dodatkom 0,1mL NaCl dodatkom polianjona i dvovalentnih katjona (heparin/Mn2+) i nakon ponovnog centrifugiranja talože s apo B lipoproteini (IDL, LDL i Lp(a) HDL se određuje u supernatantu pomoću CDC RM

VLDL i LDL-H se izračunavaju na sledeći način: [VLDL-H] = [ukupan holesterol] – [d>1,006g/mLholesterol (hol.nakon I centrifugiranja)] [LDL-H] = [d>1,006g/mL holesterol] – [HDL-H]

1. Selektivna precipitacija Direktne metode direktno određivanje LDL-H selektivnom precipitacijom i homogenim određivanjem 1. Selektivna precipitacija LDL čestice se precipitiraju na osnovu svoje specifičnosti prema određenim reagensima ( heparin na pH 5.12 , polivinilsulfat, nespecifični amfipatični polimeri, dekstran sulfat) Posle centrifugiranja LDL ostaje u precipitatu U supernantantu se određuje non-LDL-H LDL-H prec = ukupni holesterol – non-LDL-H

2. Homogeno određivanje Prednosti i nedostaci direktnih LDL-H metoda: slično homogenom određivanju HDL-H komercijalno dostupno 5 različitih homogenih metoda sadrže po dva regensa Prednosti i nedostaci direktnih LDL-H metoda: potpuno automatizovane bolje klasifikuju individue prema NCEP klasifikaciji u odnosu na Friedewald formulu u postprandijalnim uzorcima dostižu NCEP kriterijume za tačnost (bias <4%) i preciznost (CV<4%) nedovoljno ispitana pouzdanost i specifičnost u uzorcima sa atipičnim LP

SOL LDL-H SUR LDL-H R1 HDL, VLDL i hilomikrone blokiraju surfaktanti R2 LDL solubilizuju surfaktanti i enzimi holestenon + H2O2 2H2O2 + 4-aminoantipirin + HSDA + enzim boja SUR LDL-H R1 surfaktant 1+ enzimi solubilizuju sve non-LDL lipoproteine perokside koje stvara non-LDL troši katalaza nema boje R2 LDL-H + surfaktant 2 + derivat toluidina + enzimi boja

PRO LDL-H R1 LDL + protecting reagens štiti LDL od enzimske reakc. HDL-H,LDL-H,HM-H + enzimi H2O2 + katalaza H2O R2 LDL-protecting reagens + deprotecting reagens LDL LDL-H + enzimi holestenon + H2O2 H2O2 + 4-aminoantipirin + HDAOS boja CAT LDL-H R1 non-LDL + surfaktant 1 + enzimi holestenon + H2O2 H2O2 + katalaza H2O R2 LDL-H + surfaktant 2 holestenon + H2O2 katalaza + azid inhibicija H2O2 + 4-AA + HDAOS + enzimi boja

Subfrakcije LDL kao faktori rizika za KVB CAL LDL-H R1 LDL + Calixaren LDL-Calixaren rastvorljivi kompleks non-LDL + enzimi + hidrazin holestenon hidrazon R2 LDL-H + β-NAD + enzimi holestenon hidrazon + β-NADH Subfrakcije LDL kao faktori rizika za KVB postoje četiri subklasa LDL-a (LDLI, LDLII, LDLIII i LDLIV) broj subfrakcija LDL zavisi i od primenjene metode separacije razlikuju po svojoj veličini, gustini, sadržaju holesterola i triglicerida i najvažnije po svojoj aterogenosti (poseban značaj male guste LDL čestice)

Metode određivanja subfrakcija Razdvajanje subfrakcija LDL i HDL omogućeno je primenom savremenih metoda separacije poput: (1) ultracentrifugiranja – razdvajanja na osnovu gustine (2) elektroforezom na poliakrilamidnom gelu odnosno gradijent gel elektroforeza (GGE) razdvajanja pre svega na osnovu veličine i ona omogućava određivanje dijametra razdvojenih čestica (mogu se odrediti male guste LDL čestice-dijametar <25,5 nm fenotip B; dijametar >25,5 fenotip A) (3) nuklearne magnetne rezonance

Fenotip B - aterogeni lipoproteinski fenotip ALP male guste LDL čestice, sadrže više TG, viši VLDL i IDL niži HDL holesterol Aterogenost LDL čestica se može proceniti sledećim laboratorijskim određivanjima: 1. Koncentracija LDL-holesterol 2. Koncentracija apo B 3. Veličina LDL čestica 4. Koncentracije apo B i holesterola u LDL subfrakcijama

Zaključak: Za postavljanje dijagnoze dislipidemija potrebno je odrediti odnos proaterogenih čestica koje dominiraju u cirkulaciji u odnosu na antiaterogene koje su smanjene. U laboratoriji određujemo lipidni status koji nam omogućava dijagnostiku dislipidemija, ali i procenu aterogenog rizika. Obzirom da se sve lipidne komponente u cirkulaciji nalaze u vidu lipoproteina laboratorijska dijagnostika se i zasniva na analizi lipoproteinskih čestica.