ΥΠΟΘΕΣΗ ΕΝΑΛΛΑΚΤΙΚΗΣ ΕΝΑΡΞΗΣ ΤΗΣ ΜΕΤΑΦΡΑΣΗΣ ΤΟΥ ΓΟΝΙΔΙΟΥ AT3G53130 ΚΑΙ ΔΥΑΔΙΚΗ ΚΥΤΤΑΡΙΚΗ ΤΟΠΟΘΕΤΗΣΗ Πρακτική άσκηση Ιουλίου –Αυγούστου 2012 Μίχου Μυρσίνη Γ16336 Υπεύθυνος : Σταμάτης Ρήγας Εργαστήριο Μορφολογίας & Φυσιολογίας φυτών ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ

40S 60S 40S 60S 40S 60S 40S Met 1 Met 64 CHLOROPLAST MITOCHONDRIA 40S Met 31 Met 64 Met 1 Met 64 CGTTTT AUG CATC TCATCA AUG GAGT 2 Περιπτώσεις: Εάν το ριβόσωμα αναγνωρίσει και προσδεθεί πάνω στο 1 ο AUG παράγεται 1 μεγάλο πεπτίδιο το οποίο τοποθετείται στο Μιτοχόνδριο. Εάν το ριβόσωμα προσπεράσει το 1 ο AUG και προσδεθεί πάνω στο 2 ο AUG, τότε παράγεται ένα μικρότερο πεπτίδιο (ισομορφή της πρωτεΐνης), το οποίο και τοποθετείται στον Χλωροπλάστη.

Top Seven Group I AUG1AUG2 Βάση βιοπληροφορικής ανάλυσης βρέθηκαν 24 γονίδια του Arabidopsis Thaliana τα οποία έχουν 2 AUGs στο ίδιο αναγνωστικό πλαίσιο. Στηριζόμενοι στο ποσοστό ομοιότητας μεταξύ των Kozaks αυτών των γονιδίων, κατηγοριοποιήθηκαν σε 3 groups.Παρατηρήθηκε πως το 2 ο AUG είναι συντηρημένο(strong) ανάμεσα στα γονίδια, ενώ το 1 ο όχι(weak). Το γονίδιο AT3G53130 (carotenoid epsilon-ring hydroxylase) ανήκει στο 1 ο group και πιθανότατα ό ρόλος του σχετίζεται με τη δέσμευση οξυγόνου καθώς και τη σύνθεση Καροτενοιδών.

Βιοπληροφορική ανάλυση AT3G53130 cDNA translation with both AUGs Targeting prediction Literature data for chroroplast targeting “Proteomic Study of the Arabidopsis thaliana Chloroplastic Envelope Membrane Utilizing Alternatives to Traditional Two- Dimensional Electrophoresis” Journal of Proteome Research (2003) Envelope Membrane Proteins Identified Exclusively by Off-line MUDPIT: AT3G53130, cytochrome P450-like, localized at the inner envelope. “AT_CHLORO, a Comprehensive Chloroplast Proteome Database with Subplastidial Localization and Curated Information on Envelope Proteins” Molecular & Cellular Proteomics (2010) Supplemental Data Table S8: cTP (ChloroP), Chloro (TargetP), plastid (PPDB). Supplemental Data Table S9: 100% envelope. “Sorting Signals, N-Terminal Modifications and Abundance of the Chloroplast Proteome” PLoS One (2008) M HRRPYPRVTVRVSTQSQIFLHGSFEKRSS M ESSLFSPSSSSYSSLFTAKPTRLLSPKPKFTFSIRSSIEKPKPKLETNSSKSQSWVSPDW Υπόθεση υποκυτταρικής στόχευσης: Met1/ Met 31 -> Mito/Chloro

AT3G CaMV 35SYFP 93 bp Met 1 Met 31 CGTTTT AUG CATC TCATCA AUG GAGT Πραγματοποιήθηκε παροδική έκφραση της κατασκευής του γονιδίου σε καπνούς N. benthamiana ( Tobacco epidermal cell infiltration). Ακολούθησε μικροσκοπική παρατήρηση της παροδικής έκφρασης στα επιδερμικά κύτταρα μετασχηματισμένων φύλλων σε ορατό φίλτρο και υπό την επίδραση UV ακτινοβολίας σε κόκκινο και GFP φίλτρο. Τελική κατασκευή

Microscopy Φίλτρο ορατούΚόκκινο φίλτρο GFP φίλτρο Επικόλληση εικόνας κόκκινου –πράσινου φίλτρου για εύρεση, αν κατευθύνεται η πρωτεΐνη, σε μιτοχόνδρια ΧλωροπλάστηςΧλωροπλάστης Κίτρινο χρώμα: αποτέλεσμα επικάλυψης κόκκινου-GFP φίλτρου -> πρωτεΐνη στον χλωροπλάστη

Από την μικροσκοπική παρατήρηση επιδερμικών κυττάρων καπνού,στα οποία είχε εισαχθεί με τη μέθοδο του Agroinfiltration η υπό μελέτη κατασκευή, μέσω της χρήσης ακτινοβολίας UV και κατάλληλων φίλτρων, συμπεράναμε πως: 1) Η παραγόμενη πρωτεΐνη, και όταν ακολουθείται έναρξη μετάφρασης από το 2 ο AUG(strong), αλλά και όταν ακολουθείται εναλλακτική (από το 1 ο AUG(weak)), κατευθύνεται μόνο στους χλωροπλάστες και σε κανένα άλλο υποκυτταρικό οργανίδιο. 2) Η κατασκευή λειτουργεί καθώς μπορούμε, μέσω φθορισμού, να διακρίνουμε την υποκυτταρική τοποθέτηση των ισομορφών της πρωτεΐνης.