ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΑΠΡΙΛΙΟΣ-ΜΑΙΟΣ 2012 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΩΝ ΤΜΗΜΑ ΓΕΩΠΟΝΙΚΗΣ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΟ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΚΑΡΑΓΕΩΡΓΟΥ ΑΙΚΑΤΕΡΙΝΗ Γ

ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΚΑΙ ΠΟΣΟΤΙΚΟΣ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΜΕ ΤΗ ΜΕΘΟΔΟ BRADFORD Πραγματοποιήθηκε λειοτρίβηση των φυτικών ιστών (νεαρά φύλλα, άνθη, δρύπες, έμβρυα, ενδοσπέρμια και μεσοκάρπια διαφορετικών εβδομάδων) και προσθήκη Hepes buffer και pmsf 10 mM στις κατάλληλες ποσότητες Μετά τη φυγοκέντρηση και το διαχωρισμό σε ανώτερη κ μεσαία φάση ακολούθησε ποσοτικός προσδιορισμός των πρωτεϊνικών δειγμάτων με τη μέθοδο Bradford.

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ ΠΟΣΟΤΙΚΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΥ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ W.1W.4W.7W.9W.13W.16W.17W.21W.29 ΑΝΘΗmg/ml total/ mg ΕΜΒΡΥΑmg/ml total/ mg ΕΝΔΟΣΠ ΕΡΜΙΑ mg/ml total/ mg ΔΡΥΠΕΣmg/ml total/ mg ΝΕΑΡΑ ΦΥΛΛΑ

ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΧΕΙΡΙΣΜΟΙ ΜΕ TCA, ACETONE, AMMONIUM SULFATE Τα δείγματα συνήθως περιέχουν ουσίες που δυσχεραίνουν την περαιτέρω ανάλυση Οι χειρισμοί με τις χημικές αυτές ενώσεις προκαλούν καθίζηση των πρωτεϊνών και καθαρισμό των δειγμάτων από ανεπιθύμητες ουσίες Πραγματοποιήθηκαν σε πρωτεϊνικά δείγματα από ν. φύλλα, άνθη, δρύπες και μεσοκάρπια

ΑΝΑΛΥΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΙΚΩΝ ΔΕΙΓΜΑΤΩΝ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑΤΑ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ SDS Πρωτεϊνικά δείγματα από έμβρυα, ενδοσπέρμια και μεσοκάρπια διαφόρων εβδομάδων αναλύθηκαν ηλεκτροφορητικά σε πηκτώματα πολυακρυλαμίδης, παρουσία SDS. Κατά την ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιήθηκε πρότυπο διάλυμα πρωτεϊνών γνωστών μοριακών βαρών (marker) και σε συνδυασμό με τη σχετική κινητικότητα των πρωτεϊνών στο πήκτωμα (Relative Mobility) κατασκευάστηκε για κάθε πήκτωμα το αντίστοιχο διάγραμμα.

ΧΡΩΣΗ ΤΟΥ ΠΗΚΤΩΜΑΤΟΣ ΠΟΛΥΑΚΡΥΛΑΜΙΔΗΣ Χρώση με Coomassie Brilliant Blue G-250 Η διακριτική της ικανότητα επιτρέπει την ανίχνευση 100 ng πρωτεϊνών Χρώση με νιτρικό άργυρο (AgNO 3) Μέθοδος με μεγαλύτερη ευαισθησία από την παραπάνω. Επιτρέπει την ανίχνευση έως και 5 ng πρωτεϊνών

15 kDa 20 kDa 37 kDa 50 kDa 75 kDa α β γ δ ε Lane1:protein marker(10μl), Lane2:em.w.15(3μl) Lane3:em.w.16(3μl), Lane4:em.w.21(3μl), Lane5:em.w.29(3μl), Lane6:end.w.14(6μl), Lane7:end.w.16(6μl), Lane8:end.w.21(3μl), Lane9:end.w.30(3μl) Lane10:mes.w.14(3μl), Lane11:mes.w.27(3μl) Lane12:em.w.15-upper phase-(6μl) SDS gel 8% acrylamide

ΠρωτεΐνηΣχετική κινητικότηταΜοριακό Βάρος (kDa) α (πράσινο χρώμα) β (κίτρινο χρώμα) γ (κόκκινο χρώμα) δ (ροζ χρώμα) ε (μπλε χρώμα)

Lane 1: protein marker (12 μl) Lane2: em. w. 16 (10 μl) Lane 3: mes. w. 15 (10 μl) Lane 4: mes. drupes 5-6 mm. (10 μl) kDa 90 kDa 75 kDa 50 kDa 37 kDa 20 kDa 15 kDa α β γ εδεδ SDS gel 12% acrylamide

ΠρωτεΐνηΣχετική Κινητικότητα Μοριακό Βάρος (kDa) α (πράσινο χρώμα) β (κίτρινο χρώμα)0.5934,551 γ (κόκκινο χρώμα) δ (ροζ χρώμα) ε (μπλε χρώμα)

Lane 1: protein marker(12μl) Lane 2: em. w. 16(10μl) Lane 3: mes. w. 15 (20μl)(χειρισμός με TCA) 15 kDa 20 kDa 37 kDa 50 kDa 75 kDa 110 kDa 95 kDa α β γ δ ε στ 123 SDS gel 12% acrylamide

ΠρωτεΐνηΣχετική ΚινητικότηταΜοριακό Βάρος (kDa) α (πράσινο χρώμα) β (κίτρινο χρώμα) γ (κόκκινο χρώμα) δ (ροζ χρώμα) ε (μπλε χρώμα) στ (πορτοκαλί χρώμα)

WESTERN BLOT Βασίζεται στην ηλεκτροφορητική μεταφορά πρωτεϊνών από πήκτωμα πολυακρυλαμίδης SDS κ την ακινητοποίηση της σε κάποιο σταθερό μέσο, κυρίως φίλτρο νιτροκυτταρίνης, όπου τα αντιγονικά επιτόπια της πρ.-στόχου αντιδρούν με κάποιο αντίσωμα (1 ο αντίσωμα) Για την ανίχνευση του συμπλόκου αντιγόνου-αντισώματος, χρησιμοποιείται 2 ο αντίσωμα, το οποίο είναι συζευγμένο με κάποιο ένζυμο-π.χ. αλκαλική φωσφατάση, ώστε να μπορεί να ανιχνευθεί Η νιτροκυτταρίνη έχει τη δυνατότητα δέσμευσης πρωτ μgr/cm² κ διάμετρο πόρων 0.45 μm Οι ελεύθερες περιοχές της μεμβράνης καλύπτονται με κάποιο παρεμποδιστικό μέσο (σκόνη αποβουτυρωμένου γάλακτος 3% ή BSA 3%),ώστε να ελαχιστοποιηθούν οι μη εξειδικευμένες αντιδράσεις

Α) control Lane 1: em. w. 15 (7μl),Lane 2: em. w. 21 (7μl), Lane 3: end. w. 16 (14μl), Lane 4: end. w. 30 (7μl), Lane 5: mes. w. 21 (20μl) Β) Lane 1: protein marker (10μl), Lane 2: em. w. 15 (7μl), Lane 3: em. w. 21 (7μl), Lane 4: end. w. 16 (14μl), Lane 5: end. w. 30 (7μl), Lane 6: mes. w. 21 (20μl) controlΑ.Α kDa B. 1 ο αντίσωμα: IgG από κουνέλι αραίωση 1: ο αντίσωμα: Anti-rabbit IgG (Fc) αραίωση 1:7000