Τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA- Ένζυμα περιορισμού Η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA αποτελεί τη βάση της κλωνοποίησης. Κλωνοποίηση είναι η τεχνική με την οποία ένα συγκεκριμένο ξένο τμήμα DNA παράγεται σε μεγάλες ποσότητες αφού πρώτα εισαχθεί σε ένα κύτταρο ξενιστή, όπως σε ένα βακτήριο ή ζύμη. Το τμήμα DNA που πρόκειται να μεταφερθεί σε άλλο οργανισμό πρέπει πρώτα να εισαχθεί σε κατάλληλο φορέα κλωνοποίησης για να μπορέσει στη συνέχεια να περάσει στο κύτταρο ξενιστή και να πολλαπλασιαστεί. Ένας τέτοιος φορέας είναι τα πλασμίδια. Είναι μικρά κυκλικά μόρια DNA (2-4 kb), που βρίσκονται στα βακτήρια σε αρκετά αντίτυπα, διαχωρίζονται εύκολα από το βακτηριακό χρωμόσωμα και αναπαράγονται ανεξάρτητα από αυτό. Μια κλασική εφαρμογή της παραπάνω τεχνολογίας είναι η εισαγωγή του γονιδίου της ανθρώπινης ινσουλίνης σε ένα πλασμίδιο ενός βακτηρίου. Έτσι μπορούν να παραχθούν μεγάλες ποσότητες της συγκεκριμένης ορμόνης για την κάλυψη των αναγκών που πάσχουν από σακχαρώδη διαβήτη. 1

Βασικές τεχνικές στην Τεχνολογία Ανασυνδυασμένου DNA. Οι πιο βασικές τεχνικές που χρησιμοποιεί η νεα τεχνολογία είναι: -Ειδικό κόψιμο του DNA με ενδονουκλεάσες περιορισμού. -Υβριδοποίηση νουκλεϊνικών οξέων. -Κλωνοποίηση του DNA. -Προσδιορισμός της πρωτοδιάταξης του DNA. 2

Σύστημα περιορισμού και τροποποίησης (restriction- modification system). Στην πορεία της εξέλιξης εμφανίστηκε ένα ενζυμικό σύστημα, που στοχεύει στον περιορισμό της ανάπτυξης και επιβίωσης φάγων DNA, οι οποίοι μολύνουν τα βακτήρια. H λειτουργία του συστήματος βασίζεται σε δύο ενζυμικές δράσεις. Από τη μια η ενδονουκλεάση περιορισμού, αναγνωρίζει και διασπά υδρολυτικά συγκεκριμένες αλληλουχίες, ταυτόχρονα και στους δύο κλώνους του μορίου του DNA. Τα ένζυμα περιορισμού δεν αποικοδομούν το δίκο τους DNA, καθώς μια μεθυλάση, τροποποιεί τις ίδιες ακολουθίες του βακτηρίου, προσθέτοντας ένα μεθύλιο σε μια αδενίνη ή κυτοσίνη της ακολουθίας. Αυτή τη θέση δεν την αναγνωρίζει το ένζυμο περιορισμού ώστε να αποικοδομεί μόνο το ξένο DNA του φάγου, θωρακίζοντας βιοχημικά το βακτήριο. 3

Θέσεις περιορισμού Τα ένζυμα περιορισμού είναι ειδικά κατασκευασμένα για να σπάζουν δίκλωνα μόρια. Καθένα αναγνωρίζει ακολουθίες 4-8 νουκλεοτιδίων που έχουν ένα άξονα συμμετρίας και «κόβουν» το DNA μέσα σε αυτές τις ακολουθίες. Οι θέσεις αυτές καλούνται «θέσεις περιορισμού». Μια θέση αναγνώρισης για κάθε τετρανουκλεοτίδιο θα βρίσκεται κάθε 4 4 (256) νουκλεοτίδια. Αντίστοιχα, για ένα εξανουκλεοτίδιο θα βρίσκεται κάθε4 6 (4096) νουκλεοτίδια. Τα διαφορετικά είδη των βακτηρίων έχουν διαφορετικά ένζυμα περιορισμού. Οι ακολουθίες που αναγνωρίζονται είναι συνήθως παλίνδρομα. Δηλαδή οι αλληλουχίες στους δυο κλώνους DNA είναι ίδιες στο σημείο αναγνώρισης όταν διαβάζονται στην κατεύθυνση 5’->3’ στον κάθε κλώνο 4

Θέση αναγνώρισης Ανάλογα με τον τρόπο πέψης, τα ένζυμα περιορισμού δημιουργούν τμήματα DNA με συμπληρωματικά (κολλώδη) ή τυφλά (λεία) άκρα. Το πρώτο ένζυμο που ανακαλύφθηκε ήταν στην Ε.coli και πήρε το όνομα EcoRI. Mέχρι σήμερα έχουν ανακαλυφθεί περισσότερα από 500 συστήματα περιορισμού. Τα ένζυμα αυτά είναι πολύτιμα εργαλεία στην κλωνοποίηση του DNA και στην υβριδοποίηση των νουκλεϊνικών οξέων και αποτελούν τη βάση της ανάπτυξης του κλάδου της Γενετικής Μηχανικής. 5

Ανάλυση θραυσμάτων DNA με ηλεκτροφόρηση Τα θραύσματα περιορισμού μπορούν να διαχωριστούν σε πήκτωμα αγαρόζης και η θέση τους είναι ορατή με αυτοραδιογραφία ή με μια ουσία (βρωμιούχο αιθίδιο) που παρεμβάλεται μεταξύ των βάσεων του DNA και φθορίζει όταν εκτεθεί σε υπεριώδη ακτινοβολία (UV). Χρησιμοποιώντας πολλά διαφορετικά ένζυμα μπορούμε να κατασκευάσουμε ένα χάρτη περιορισμού του DNA, δηλαδή ένα χάρτη που να δείχνει τις μοναδικές θέσεις που κόβουν τα διάφορα ένζυμα σε ένα κομμάτι DNA. H τεχνική αυτή χρησιμοποιείται στη διαγνωστική ιατρική, στην εγκληματολογία, στην ανάλυση γονιδιωμάτων των διαφόρων οργανισμών και στην εύρεση εξελικτικών σχέσεων μεταξύ τους. Το πρότυπο των ζωνών που παίρνουμε ως απότελεσμα της χρήσης των περιοριστικών ενδονουκλεασών λέγεται αποτύπωμα DNA (DNA fingerprint). 6

Χάρτης περιορισμού Tα κομμάτια του DNA που παράγονται από μια περιοριστική ενδονουκλεάση μπορούν να διαχωριστούν ανάλογα με το μέγεθος της, με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Χρησιμοποιώντας πολλά διαφορετικά ένζυμα περιορισμού μεμονωμένα και σε συνδυασμούς, είναι δυνατό να κατασκευαστεί ο χάρτης περιορισμού του DNA, όπου φαίνονται οι θέσεις περιορισμού των ενζύμων που χρησιμοποιήσαμε. Στο πήκτωμα αγαρόζης ηλεκτροφορούνται συγχρόνως και πρότυπα γνωστού ΜΒ και καθορίζονται τα μεγέθη των κομματιών DNA. 7

Χάρτης Περιορισμού Σχεδιάστε τον χάρτη περιορισμού ενός γραμμικού μορίου DNA, σύμφωνα με τα παρακάτω δεδομένα. Ο χάρτης θα πρέπει να δείχνει τις σχετικές αποστάσεις των θέσεων περιορισμού σε σχέση με τα δύο άκρα του μορίου. DNAΜεγέθη τμημάτων (bp) ολικό DNA (χωρίς πέψη)10000 DNA με EcoRI8000,2000 DNA με BamHI5000,5000 DNA με EcoRI + BamHI5000,3000,2000 8

Ηλεκτροφόρηση DNA 9 To DNA είναι αρνητικά φορτισμένο μακρομόριο. Το δείγμα τοποθετείται σε μια εγκοπή που σχηματίζουμε στην πηκτή η οποία εμβαπτίζεται σε κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Εφαρμόζεται ηλ. Πεδίο και τα τμήματα του DNA μετακινούνται από τον αρνητικό στο θετικό πόλο. Η πηκτή της αγαρόζης λειτουργεί σαν ένα είδος μοριακού κοσκίνου μέσα στους πόρους της οποίας τα τμήματα του DNA διαχωρίζονται.

Ηλεκτροφόρηση DNA Τα μικρότερα τμήματα θα κινούνται γρηγορότερα και τα μεγαλύτερα αργότερα για συγκεκριμένο χρόνο εφαρμογής ηλεκτρικού πεδίου. Τμήματα DNA που έχουν το ίδιο μέγεθος κινούνται συγχρόνως μέσω της πηκτής και συγκεντρώνονται σε ζωνώσεις. Όσο πιο μεγάλη είναι η συγκέντρωση της αγαρόζης, τόσο πιο καλά διαχωρίζονται τα μικρού σχετικού μεγέθους μόρια. Το μοριακό βάρος κάθε ζώνωσης καθορίζεται από μια πρότυπη καμπύλη, η οποία κατασκευάζεται με τη χρήση μακρομορίων γνωστού ΜΒ. Ο δείκτης ΜΒ πρέπει να καλύπτει όλο το εύρος διαχωρισμού μιας πηκτής. Οι μονάδες μέτρησης του ΜΒ για δίκλωνο DNA είναι ζεύγη βάσεων (bp). 10