Tι είναι οι Πρωτεϊνες Οι πρωτεΐνες αποτελούν τα πιο διαδεδομένα και πολυδιάστατα τόσο στη μορφή όσο και στη λειτουργία τους μακρομόρια. Είναι μεγάλα σύνθετα βιομόρια, με μοριακό βάρος από μέχρι πάνω από 1 εκατομμύριο, αποτελούμενα από αμινοξέα, τα οποία ενώνονται μεταξύ τους με πεπτιδικούς δεσμούς σχηματίζοντας μια γραμμική αλυσίδα, καλούμενη αλυσίδα πολυπεπτιδίων. Oι πρωτεΐνες περιέχουν άνθρακα, οξυγόνο και άζωτο και θείο.μακρομόριαβιομόριαμοριακό βάροςαμινοξέαπεπτιδικούς δεσμούςαλυσίδα πολυπεπτιδίωνάνθρακαοξυγόνοάζωτοθείο Η ακολουθία αμινοξέων σε μια πρωτεΐνη καθορίζεται από ένα γονίδιο και κωδικοποιείται κατά τον γενετικό κώδικα DNA.ακολουθία αμινοξέωνγονίδιογενετικό κώδικα DNA Μελέτη πρωτεϊνών Προσδιορισμός της αλληλουχίας των αμινοξέων (αποικοδόμηση κατά Edman, NMR). Κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ – ο προσδιορισμός της τρισδιάστατης δομής σε ατομικό επίπεδο.

Βιολογικός ρόλος Οι διάφορες λειτουργίες που παρατηρούνται στους οργανισμούς γίνονται χάρη στις πρωτεΐνες. Ο δε βιολογικός τους ρόλος καθορίζεται κάθε φορά από την τρισδιάστατη δομή τους που είναι συνέπεια της αλληλουχίας των αμινοξέων, η οποία και ξεκινά από την πρωτοταγή δομή.οργανισμούς Οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητα συστατικά στη διατροφή μας, δεδομένου ότι τα ζώα δεν μπορούν να συνθέσουν όλα τα αμινοξέα, αλλά πρέπει να τα λάβουν από τα τρόφιμα. Μέσω της διαδικασίας της πέψης, τα ζώα αποικοδομούν την πρωτεΐνη στα ελεύθερα αμινοξέα που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρωτεϊνική σύνθεση.πέψηςπρωτεϊνική σύνθεση

Ρόλος των πρωτεϊνών Όπως άλλα βιολογικά μακρομόρια (π.χ. οι πολυσακχαρίτες, τα λιπίδια, και νουκλεϊκά οξέα) έτσι και οι πρωτεΐνες είναι απαραίτητες για όλους τους ζωντανούς οργανισμούς και συμμετέχουν σε κάθε διαδικασία μέσα στα κύτταρα.μακρομόριαπολυσακχαρίτεςλιπίδιανουκλεϊκά οξέα Πολλές πρωτεΐνες δρουν ως ένζυμα που καταλύουν τις βιοχημικές αντιδράσεις, και είναι ζωτικής σημασίας στο μεταβολισμό.ένζυμαβιοχημικές αντιδράσειςμεταβολισμό Άλλες πρωτεΐνες έχουν δομικές ή μηχανικές λειτουργίες, όπως οι πρωτεΐνες του κυτταρικού σκελετού, οι οποίες συμβάλλουν στη διατήρηση της μορφής των κυττάρων.κυτταρικού σκελετού Οι πρωτεΐνες είναι επίσης σημαντικές στη διακυτταρική επικοινωνία και τη δράση του ανοσοποιητικού συστήματος.διακυτταρική επικοινωνίαανοσοποιητικού συστήματος

Αρχιτεκτονική δομή των πρωτεϊνών Πρωτοταγής δοµή: Η αλληλουχία των αµινοξέων που συνδέονται µε πεπτιδικούς δεσµούς για να δηµιουργήσουν την πρωτεϊνική αλυσίδα. ∆ευτεροταγής δοµή: Κανονικές δοµές που απαντώνται συχνά στις πρωτεΐνες και οφείλονται σε δεσµούς υδρογόνου που δηµιουργούνται µεταξύ του οξυγόνου ενός καρβοξυλίου και του υδρογόνου µίας αµινοµάδας. Τριτοταγής δοµή: Είναι η τρισδιάστατη δοµή της πρωτεΐνης. Οφείλεται στις αλληλεπιδράσεις µεταξύ των πλευρικών οµάδων των αµινοξέων. - ∆ισουλφιδικοί δεσµοί. - ∆εσµοί υδρογόνου. - Υδρόφιλες και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις. - Ιοντικές έλξεις και απώσεις. Τεταρτοταγής δοµή: Η σχέση στο χώρο των διαφορετικών πολυπεπτιδικών αλυσίδων ή υποµονάδων µίας πρωτεΐνης. Οφείλονται σε µη οµοιοπολικές αλληλεπιδράσεις.

Εκχύλιση πρωτεϊνών – Διαχωρισμός πρωτεϊνών Εκχύλιση Τεμαχισμός ιστού (πέψη με κολλαγονάση) και ομογενοποίηση κυττάρων. Eκχύλιση με κατάλληλο ρυθμιστικό διάλυμα. Χρήση απορρυπαντικού. Κλασμάτωση (απομόνωση πρωτεϊνών συγκεκριμένων οργανιδίων). Διαχωρισμός βάσει μεγέθους, φορτίου, διαλυτότητας, ειδικής σύνδεσης με μόρια. Δ ιαλυτότητα (π. χ. προσθήκη οργανικών διαλυτών σε υδατικό διάλυμα) Μεταβολή του pH. Προσρόφηση από ουσίες (πχ ενεργός άνθρακας, αλουμίνα). Καθίζηση με άλατα (salting out). Χρωματογραφία.

Διαφορική φυγοκέντρηση Για να γίνει σωστά η απομόνωση πρέπει να υπάρχει μια δοκιμασία (essay) ώστε να επιβεβαιωθεί η παρουσία της πρωτεΐνης στο διάλυμα. Η δοκιμασία αυτή πρέπει να είναι όσο το δυνατό πιο εξειδικευμένη για τη πρωτεΐνη που ψάχνουμε ώστε ο καθαρισμός να γίνει αποτελεσματικότερος. Αν η πρωτεΐνη είναι ένζυμο, τότε αυτή η δοκιμασία βασίζεται συνήθως στην αντίδραση που καταλύει. Ο καθαρισμός αρχίζει με την φυγοκέντρηση ενός ομογενοποιήματος, το οποίο αποτελείται από κύτταρα χωρίς την κυτταρική μεμβράνη τους.φυγοκέντρησηκυτταρική μεμβράνη Η φυγοκέντρηση γίνεται σε τρεις φάσεις στις οποίες χωρίζονται τα μέρη του κυττάρου. Σε κάθε φάση το υπερκείμενο φυγοκεντρείται ξανά σε μεγαλύτερη ταχύτητα για περισσότερη ώρα. Αυτή η διαδικασία λέγεται διαφορική φυγοκέντρηση και από αυτή προκύπτουν κλάσματα ελαττωμένης πυκνότητας. Αρχικά καθιζάνει το πυρηνικό κλάσμα, μετά το μιτοχονδριακό κλάσμα και τέλος το μικροσωμικό κλάσμα, ενώ το υπερκείμενο της τελευταίας φυγοκέντρησης περιέχει τις διαλυτές πρωτεΐνες. Ένα κλάσμα από αυτά θα έχει μεγαλύτερη ενεργότητα και αυτό θα επιλεγεί για περαιτέρω καθαρισμό.

Καθαρισμός πρωτεϊνών Το κλάσμα που προέκυψε από τη φυγοκέντρηση περιέχει χιλιάδες διαφορετικές πρωτεΐνες. Διακριτά χαρακτηριστικά των πρωτεϊνών, όπως είναι η διαλυτότητα, το φορτίο, το μέγεθος και η αλληλεπίδραση με άλλες ουσίες λόγω χημικής συγγένειας. Μια πρώτη διαδικασία που χρησιμοποιείται είναι η εξαλάτωση. Οι περισσότερες πρωτεΐνες παρουσιάζουν μικρή διαλυτότητα σε υψηλή συγκέντρωση άλατος, με αποτέλεσμα η εξαλάτωση να χρησιμεύει για τη κλασμάτωση των πρωτεϊνών. Το περιττό άλας στη συνέχεια μπορεί να απομακρυνθεί με τη μέθοδο της διαπ ί δ υ σης.εξαλάτωσηάλατοςδιαπ ί δ υ σης

Καθίζηση με άλατα (salting out) Το θειικό αμμώνιο είναι ένα από τα άλατα που χρησιμοποιούνται συνηθέστερα για την καθίζηση των πρωτεϊνών.

Διαπίδυση μέθοδος διαχωρισμού μίας πρωτεΐνης από μικρότερα μόρια

Καθαρισμός πρωτεϊνών Ο διαχωρισμός με βάση το μέγεθος γίνεται με χρωματογραφία διήθησης σε πηκτή. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται μέσα από μια στήλη που περιέχει πορώδες πολυμερές.χρωματογραφία διήθησης σε πηκτήπολυμερές Ο διαχωρισμός με βάση το φορτίο γίνεται με βάση το φορτίο γίνεται με χρωματογραφία ιοντοανταλλαγής. Το μίγμα πρωτεϊνών διέρχεται από μια στήλη με φορτισμένα ιόντα (είτε θετικά είτε αρνητικά), ενώ βρίσκεται σε pH 7. Οι πρωτεΐνες φορτισμένες αντίθετα με τα ιόντα θα παραμείνουν μέσα στη στήλη, ενώ οι υπόλοιπες θα διέλθουν.χρωματογραφία ιοντοανταλλαγήςpH Τέλος, η χρωματογραφία συγγένειας βασίζεται στην υψηλή συγγένεια με μία χημική ουσία, με αποτέλεσμα όταν διέλθουν από μια στήλη που τη περιέχει, η πρωτεΐνη να παραμείνει σε αυτή.χρωματογραφία συγγένειας

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE) Διαχωρισμός πρωτεϊνών ασυνεχούς πηκτής -Πηκτή επιστοίβασης (stacking gel) 4 % ακρυλαμίδιο/ pH: Πηκτή διαχωρισμού (seperating gel) 12 % ακρυλαμίδιο/ pH: 8.8. Το Running buffer περιέχει γλυκίνη. Στο stacking gel η γλυκίνη έχει μικρό αρνητικό φορτίο, βοηθάει στη συσσώρευση πρωτεϊνών. Στο seperating gel η γλυκίνη αποκτά μεγαλύτερο αρνητικό φορτίο και προπορεύεται των πρωτεϊνών οι οποίες υστερούν λόγω τριβών.

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE) Οι πρωτεΐνες που διαχωρίζονται με ηλεκτροφόρηση μπορούν να εμφανιστούν a) με χρώση Coomassie brilliant blue (1μg). b) με χρώση Ag (0,2μg). c) με φιλμ ακτινογραφίας σεπερίπτωση ραδιενεργής επισήμανσης. Η SDS-PAGE δεν είναι κατάλληλη για καθαρισμό πρωτεϊνών παρά μόνο για ποιοτικό προσδιορισμό και εύρεση Μ.Β. αυτών.

Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών (SDS-PAGE) Το SDS καταστρέφει όλες σχεδόν τις μη ομοιοπολικές αλληλεπιδράσεις στην τριτοταγή δομή των πρωτεϊνών και αποκτούν μεγάλο αρνητικό φορτίο (1 μόριο SDS/2 αμινοξέα). Η μερκαπτοαιθανόλη ανάγει τουςδισουλφιδικούς δεσμούς.

Ισοηλεκτρική εστίαση Δημιουργία στην πηκτή μιας βαθμίδωσης pH ηλεκτροφορώντας ένα μίγμα ηλεκτρολυτών. Μετά την τοποθέτηση του δείγματος των πρωτεϊνών, το ηλεκτρικό ρεύμα θα οδηγήσει τις πρωτεΐνες στο ισοηλεκτρικό τους σημείο. Οι πρωτεΐνες μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε άλλα πειράματα αν κόψουμε τις αντίστοιχες ζώνες.

Ηλεκτροφόρηση 2 διαστάσεων Πρόκειται για συνδυασμό του ισοηλεκτρικού εστιασμού με την ηλεκτροφόρηση SDS – PAGE. Η μέθοδος επιτυγχάνει διαχωρισμούς υψηλής διακριτικής ικανότητας και αποτελεί ένα από τα πρώτα πειραματικά βήματα που θα καταλήξουν στην πρωτεομική, δηλαδή τη μελέτη του συνόλου των πρωτεϊνών ενός οργανισμού.

Απομόνωση πρωτεϊνών Ο καθαρισμός πρωτεϊνών από μετασχηματισμένα κύτταρα αποτελεί συνήθη πρακτική καθαρισμού ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών. Η διαδικασία περιλαμβάνει τα παρακάτω στάδια: 1.Απομόνωση του συγκεκριμένου γονιδίου ή cDNA. 2.Έκφραση της επιθυμητής πρωτεΐνης σε υψηλά επίπεδα (μεγάλος αριθμός πλασμιδίων, ισχυροί προαγωγείς, επαγώγιμη έκφραση).

Μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεϊνης Η μέτρηση του ποσού της πρωτεϊνης κατά τα διάφορα στάδια καθαρισμού μπορεί να πραγματοποιηθεί με μια από τις ακόλουθες μεθόδους: 1.Lowry-Folin-Ciocalteau reagent (Lowry, 1951) UV απορρόφηση στα 280 nm (αρωματικός δεσμός) ή nm (πεπτιδικός δεσμός) (Goldfarb, 1951) Δέσμευση χρωστικής – Μέθοδος Bradford, 1976 Αντιδραστήριο BSA (Bovine Serum Albumin)- Smith, 1986.

Ποσοτικός Προσδιορισμός Πρωτεϊνών Συχνά στηρίζεται σε αντιδράσεις ομάδων αμινοξέων. Απαραίτητος ο προσδιορισμός ολικής πρωτεΐνης ώστε: σε κάθε στάδιο καθαρισμού να είναι γνωστό το ποσό ολικής πρωτεΐνης. Οι μέθοδοι που εφαρμόζονται στη Βιοχημεία είναι: Φασματοφωτομετρικά: Λόγω της απορρόφησης των αρωματικών δακτυλίων της τυροσίνης και της τρυπτοφάνης στα 280nm. Προσδιορισμός διουρίας (πεπτιδικοί δεσμοί αντιδρούν με Cu+2) (1- 20mg πρωτεΐνης). Lowry: αντίδραση διουρίας αλλά πιο ευαίσθητη (5μg πρωτεΐνης). Bradford Βασίζεται στην απορρόφηση (595 nm) της χρωστικής Coomassie Brilliant Blue G-250 η οποία υπό όξινες συνθήκες η κόκκινη μορφή μετατρέπεται σε μπλε μορφή. Coomassie Brilliant Blue G-250