Βιολογική Oλιστική Προσέγγιση της Δυναμικής Μορφής Επιβίωσης Παθογόνων Βακτηριακών Σχηματισμών - ΒΙΟΥΜΕΝΙΑ

Τι είναι το βιουμένιο Με τον όρο βιο-υμένιο εννοούμε μια μικροβιακή κοινότητα που προσκολλάται σε μια επιφάνεια ή μεσεπιφάνεια, αβιοτική ή όχι, συνήθως εγκλειόμενη σε στρώμα εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών παραγόμενων από τα ίδια τα μικρόβια, και τα οποία παρουσιάζουν διαφορετικό φαινότυπο όσον αφορά το ρυθμό αύξησης και τη γονιδιακή έκφραση. Προκαρυωτική ζωή υπό την μορφή των βιουμενίων, απαντάται σε ένα μεγάλο εύρος μικροβιακών οικοσυστημάτων (microbial ecosystems), τόσο φυσικά όσο και από τον άνθρωπο δημιουργούμενα, συμπεριλαμβανομένων και των ευκαρυωτικών ιστών

Πως σχηματίζεται το βιουμένιο Ο σχηματισμός βιο-υμενίου είναι μεν ένα φυσικό φαινόμενο και συμβαίνει σχεδόν οπουδήποτε υπάρχουν μικροοργανισμοί και επιφάνειες. Ουσιαστικά 4 είναι τα στάδια δημιουργίας βιουμενίων : Αρχικά γίνεται η πρωτογενής αποίκιση υποστρώματος που καλύπτεται από «μεμβράνη περιβαλλοντικής προσαρμογής» (conditioning film) αποτελούμενη από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες (a). Στην συνέχεια η αύξηση των κυττάρων, η διαίρεση τους και η παραγωγή εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών (EPS) οδηγεί στο σχηματισμό μικροαποικιών (b), ακολουθούμενη από την προσκόλληση (coadhesion) μεμονωμένων κυττάρων (single cells), συναθροίσματος κυττάρων (coaggregated cells) και ομάδων ομοειδών κυττάρων (group of identical cells) στο νέο σύνθετο βιο-υμένιο (c). Τέλος επέρχεται η Ωρίμαση (maturation) του βιο-υμενίου αποτελούμενο από διαφορετικά βακτηριακά είδη (d). Ο σχηματισμός βιο-υμενίου είναι μεν ένα φυσικό φαινόμενο και συμβαίνει σχεδόν οπουδήποτε υπάρχουν μικροοργανισμοί και επιφάνειες. Ουσιαστικά 4 είναι τα στάδια δημιουργίας βιουμενίων : Αρχικά γίνεται η πρωτογενής αποίκιση υποστρώματος που καλύπτεται από «μεμβράνη περιβαλλοντικής προσαρμογής» (conditioning film) αποτελούμενη από πολυσακχαρίτες και πρωτεΐνες (a). Στην συνέχεια η αύξηση των κυττάρων, η διαίρεση τους και η παραγωγή εξωκυτταρικών πολυσακχαριτών (EPS) οδηγεί στο σχηματισμό μικροαποικιών (b), ακολουθούμενη από την προσκόλληση (coadhesion) μεμονωμένων κυττάρων (single cells), συναθροίσματος κυττάρων (coaggregated cells) και ομάδων ομοειδών κυττάρων (group of identical cells) στο νέο σύνθετο βιο-υμένιο (c). Τέλος επέρχεται η Ωρίμαση (maturation) του βιο-υμενίου αποτελούμενο από διαφορετικά βακτηριακά είδη (d).

Βακτηριακά στελέχη που μελετήθηκαν Στο πείραμά μας μελετήσαμε τον σχηματισμό βιουμενίων του μικροοργανισμού Salmonella spp. Το γένος Salmonella ανήκει στην Οικογένεια Enterobacteriaceae Eίναι προαιρετικώς αναερόβια, αρνητικά κατά Gram ραβδία Aνήκουν στην κατηγορία των παθογόνων για τον άνθρωπο Αναπτύσσονται σε τρόφιμα ελαφρώς όξινα με pΗ 5,5 - 5,7 και μέχρι τιμής 4 Και σε θερμοκρασίες από 10°C έως 50°C Στο πείραμά μας μελετήσαμε τον σχηματισμό βιουμενίων του μικροοργανισμού Salmonella spp. Το γένος Salmonella ανήκει στην Οικογένεια Enterobacteriaceae Eίναι προαιρετικώς αναερόβια, αρνητικά κατά Gram ραβδία Aνήκουν στην κατηγορία των παθογόνων για τον άνθρωπο Αναπτύσσονται σε τρόφιμα ελαφρώς όξινα με pΗ 5,5 - 5,7 και μέχρι τιμής 4 Και σε θερμοκρασίες από 10°C έως 50°C

η παθογένεια που προκαλούν τα Salmonella sp. στα διάφορα ζώα και στον άνθρωπο οφείλεται σε ουσίες όπως, η ενδοτοξίνη (LPS), η εντεροτοξίνη και η κυτοτοξίνη. Οι τοξίνες αυτές προσβάλλουν τα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου, προκαλλώντας διάρροια, βακτηραιμία, σηψαιμία. Η σαλµονέλλωση είναι τυπική εντερολοίµωξη προκαλούμενη από μεγάλο αριθμό κυττάρων, που έχουν αναπτυχθεί στο τρόφιμο και έχουν εισαχθεί μαζί με αυτό στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου η παθογένεια που προκαλούν τα Salmonella sp. στα διάφορα ζώα και στον άνθρωπο οφείλεται σε ουσίες όπως, η ενδοτοξίνη (LPS), η εντεροτοξίνη και η κυτοτοξίνη. Οι τοξίνες αυτές προσβάλλουν τα επιθηλιακά κύτταρα του εντερικού βλεννογόνου, προκαλλώντας διάρροια, βακτηραιμία, σηψαιμία. Η σαλµονέλλωση είναι τυπική εντερολοίµωξη προκαλούμενη από μεγάλο αριθμό κυττάρων, που έχουν αναπτυχθεί στο τρόφιμο και έχουν εισαχθεί μαζί με αυτό στο πεπτικό σύστημα του ανθρώπου

Οι παθογόνοι αυτοί μικροοργανισμοί είναι ικανοί να προσκολλώνται σε επιφάνειες η σε μέσ’ επιφάνειες επεξεργασίας ή μεταποίησης των τροφίμων όπως π.χ. είναι τραπέζια κοπής & επεξεργασίας προϊόντων, κατασκευασμένα από διαφορετικά υλικά, όπως ανοξείδωτος χάλυβας, πλαστικό, γυαλί, και να σχηματίζει βιο-υμένια. Στο πείραμά μας μελετήσαμε την προσκόλληση και τον σχηματισμό βιουμενίων σε Αβιοτικές Επιφάνειες των στελεχών Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium B 137, B-193 Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί στη πληρέστερη προσέγγιση στο φαινόμενο σχηματισμού βιουμενίων από τα παραπάνω στελέχη (δημιουργία, ανάπτυξη, φυσιολογία, έλεγχος και καταστολή). Οι παθογόνοι αυτοί μικροοργανισμοί είναι ικανοί να προσκολλώνται σε επιφάνειες η σε μέσ’ επιφάνειες επεξεργασίας ή μεταποίησης των τροφίμων όπως π.χ. είναι τραπέζια κοπής & επεξεργασίας προϊόντων, κατασκευασμένα από διαφορετικά υλικά, όπως ανοξείδωτος χάλυβας, πλαστικό, γυαλί, και να σχηματίζει βιο-υμένια. Στο πείραμά μας μελετήσαμε την προσκόλληση και τον σχηματισμό βιουμενίων σε Αβιοτικές Επιφάνειες των στελεχών Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium B 137, B-193 Η παρούσα μελέτη αποσκοπεί στη πληρέστερη προσέγγιση στο φαινόμενο σχηματισμού βιουμενίων από τα παραπάνω στελέχη (δημιουργία, ανάπτυξη, φυσιολογία, έλεγχος και καταστολή).

Πορεία πειράματος Υλικά 1.COUPONS Το υλικό που το συναντούμε συχνά στις βιομηχανίες τροφίμων ως υλικό κατασκευής εξοπλισμού, είναι ο ανοξείδωτος χάλυβας. Στα εργαστηριακά πειράματα μας χρησιμοποιήσαμε κουπόνια ανοξείδωτου χάλυβα σε ορθογώνια τεμάχια διαστάσεων: 3 x 0.8 x 0.1 cm (συνολικής επιφάνειας 5,56 cm 2 ). Δώσαμε έμφαση στον καθαρισμό τους, ώστε να απομακρυνθούν υπάρχουσες ακαθαρσίες, δακτυλικά αποτυπώματα και λιπίδια. Για το λόγο αυτό τα ξεπλύναμε με καθαριστικό σαπούνι και έπειτα τα εμβαπτίσαμε σε ακετόνη ολονυκτίως. Ακολούθησε πολύ καλό ξέπλυμα με νερό βρύσης και εν συνεχεία με απιονισμένο νερό. Στο τέλος, τα κουπόνια τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες (με καπάκια) και 4.5 ml διαλύματος Ringer και αποστειρώθηκαν στους 121 ο C για 15 λεπτά. Με αυτό τον τρόπο θα εξασφαλιστεί ότι τα τεμάχια ανοξείδωτου χάλυβα πάνω στα οποία θα σχηματιστεί το βιο-υμένιο, είναι απολύτως καθαρά πριν από τον εμβολιασμό με τον εκάστοτε μικροοργανισμό. Υλικά 1.COUPONS Το υλικό που το συναντούμε συχνά στις βιομηχανίες τροφίμων ως υλικό κατασκευής εξοπλισμού, είναι ο ανοξείδωτος χάλυβας. Στα εργαστηριακά πειράματα μας χρησιμοποιήσαμε κουπόνια ανοξείδωτου χάλυβα σε ορθογώνια τεμάχια διαστάσεων: 3 x 0.8 x 0.1 cm (συνολικής επιφάνειας 5,56 cm 2 ). Δώσαμε έμφαση στον καθαρισμό τους, ώστε να απομακρυνθούν υπάρχουσες ακαθαρσίες, δακτυλικά αποτυπώματα και λιπίδια. Για το λόγο αυτό τα ξεπλύναμε με καθαριστικό σαπούνι και έπειτα τα εμβαπτίσαμε σε ακετόνη ολονυκτίως. Ακολούθησε πολύ καλό ξέπλυμα με νερό βρύσης και εν συνεχεία με απιονισμένο νερό. Στο τέλος, τα κουπόνια τοποθετήθηκαν μεμονωμένα σε γυάλινους δοκιμαστικούς σωλήνες (με καπάκια) και 4.5 ml διαλύματος Ringer και αποστειρώθηκαν στους 121 ο C για 15 λεπτά. Με αυτό τον τρόπο θα εξασφαλιστεί ότι τα τεμάχια ανοξείδωτου χάλυβα πάνω στα οποία θα σχηματιστεί το βιο-υμένιο, είναι απολύτως καθαρά πριν από τον εμβολιασμό με τον εκάστοτε μικροοργανισμό.

COUPONS (3 * 0.8 * 0.1 ) Αποθηκευμένα σε δοχεία με οινόπνευμα.

2.ΘΡΕΠΤΙΚΑ ΥΠΟΣΤΡΩΜΑΤΑ ΤSB –Tryptic Soy Broth TSA –Trypric Soy Agar Είναι δύο γενικά υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη ενός μεγάλου εύρους μικροοργανισμών. 3. RINGER Ρυθμιστικό διάλυμα. 4.FALCON WITH BEADS Beads : Γύαλινα Σφαιρίδια που χρησιμοποιούνται για την αποκόλληση των προσκολλημένων μικροοργανισμών. ΤSB –Tryptic Soy Broth TSA –Trypric Soy Agar Είναι δύο γενικά υποστρώματα που χρησιμοποιούνται για την ανάπτυξη ενός μεγάλου εύρους μικροοργανισμών. 3. RINGER Ρυθμιστικό διάλυμα. 4.FALCON WITH BEADS Beads : Γύαλινα Σφαιρίδια που χρησιμοποιούνται για την αποκόλληση των προσκολλημένων μικροοργανισμών.

Ανάδευση θρεπτικού υλικού TSB

Σωληνάκια με 5 ml TSB

Ρυθμιστικό Διάλυμα RINGER

Τρυβλία επιστρωμένα με TSA Πυραμίδα στο LAMINAR

FALCON WITH BEADS

Πορεία πειράματος Μέθοδος Bead Vortexing Στόχος : σχηματισμός βιουμενίων, αποκόλληση ελαφρά προσκολλημένων αποικιών και απαρίθμηση των ισχυρά προσκολλημένων αποικιών. Διαδικασία  Πρώτη ανανέωση βακτηριακού στελέχους : Υπο ασηπτικές συνθήκες, λήψη 10μL από το stock γλυκερόλης και μεταφορά σε 10mL υγρού θρεπτικού υποστρώματος (TSB).Ανάδευση (vortexing) και επώαση για 24 ώρες στους 37˚C  Δεύτερη ανανέωση βακτηριακού στελέχους :Ανάδευση 24-ωρης καλλιέργειας, λήψη 10μL από την 24-ωρη καλλιέργεια και μεταφορά σε 10mL υγρού θρεπτικού υποστρώματος (TSB) υπό ασηπτικές συνθήκες.Ανάδευση και επώαση για 18 ώρες στους 37˚C -Από την πρώτη ανανέωση πραγματοποιείται streaking σε γενικό στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (TSA) για να διαπιστωθεί η καθαρότητα της αρχικής καλλιέργειας. Μέθοδος Bead Vortexing Στόχος : σχηματισμός βιουμενίων, αποκόλληση ελαφρά προσκολλημένων αποικιών και απαρίθμηση των ισχυρά προσκολλημένων αποικιών. Διαδικασία  Πρώτη ανανέωση βακτηριακού στελέχους : Υπο ασηπτικές συνθήκες, λήψη 10μL από το stock γλυκερόλης και μεταφορά σε 10mL υγρού θρεπτικού υποστρώματος (TSB).Ανάδευση (vortexing) και επώαση για 24 ώρες στους 37˚C  Δεύτερη ανανέωση βακτηριακού στελέχους :Ανάδευση 24-ωρης καλλιέργειας, λήψη 10μL από την 24-ωρη καλλιέργεια και μεταφορά σε 10mL υγρού θρεπτικού υποστρώματος (TSB) υπό ασηπτικές συνθήκες.Ανάδευση και επώαση για 18 ώρες στους 37˚C -Από την πρώτη ανανέωση πραγματοποιείται streaking σε γενικό στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (TSA) για να διαπιστωθεί η καθαρότητα της αρχικής καλλιέργειας.

Πορεία πειράματος  Προετοιμασία βακτηριακού εναιωρήματος : 1)Μεταφορά της 18-ωρης καλλιέργειας σε πλαστικό δοκιμαστικό σωλήνα (falcon) 15mL 2)Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στα 5000g για 10 λεπτά στους 4˚C 3)Απομάκρυνση υπερκείμενου 4)Προσθήκη στο falcon 10mL Ringer 5)Ανάδευση 6)Φυγοκέντρηση 7)Απομάκρυνση υπερκείμενου 8)Προσθήκη 6mL Ringer 9)Ανάδευση  Προετοιμασία βακτηριακού εναιωρήματος : 1)Μεταφορά της 18-ωρης καλλιέργειας σε πλαστικό δοκιμαστικό σωλήνα (falcon) 15mL 2)Φυγοκέντρηση της καλλιέργειας στα 5000g για 10 λεπτά στους 4˚C 3)Απομάκρυνση υπερκείμενου 4)Προσθήκη στο falcon 10mL Ringer 5)Ανάδευση 6)Φυγοκέντρηση 7)Απομάκρυνση υπερκείμενου 8)Προσθήκη 6mL Ringer 9)Ανάδευση

Πορεία πειράματος  Σχηματισμός βιο-υμενίου 1)Προσθήκη υπό ασηπτικές συνθήκες, 500μL βακτηριακού εναιωρήματος σε δοκιμαστικo σωλήνα που περιέχει 4.5mL Ringer και coupon.Τοποθέτηση δοκιμαστικών σωλήνων για 3 ώρες στους 15. ˚C 2)Mετά το πέρας 3 ωρών, λήψη του κάθε coupon με λαβίδα και τοποθέτηση σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 5mL. Μετά από 5 λέπτα,λήψη με λαβίδα και τοποθέτηση σε δοκιμαστικό σωλήνα με 5mL.Επώαση στους 18 C για 24, 48 και 72 ώρες. o Για τα coupon που θα επωαστούν 48 ώρες,στις 24 ώρες θα γίνει λήψη του κάθε coupon με λαβίδα τοποθέτηση σε 5mL Ringer και έπειτα τοποθέτηση σε 5mL TSB.Συνέχιση επώασης για 24 ώρες στους 18 C.Η ίδια διαδικασία θα γίνει και στα coupon που θα επωαστουν για 48 κα 72 ώρες,μόνο που η ανανέωση θα γίνει στις 48 ώρες.  Σχηματισμός βιο-υμενίου 1)Προσθήκη υπό ασηπτικές συνθήκες, 500μL βακτηριακού εναιωρήματος σε δοκιμαστικo σωλήνα που περιέχει 4.5mL Ringer και coupon.Τοποθέτηση δοκιμαστικών σωλήνων για 3 ώρες στους 15. ˚C 2)Mετά το πέρας 3 ωρών, λήψη του κάθε coupon με λαβίδα και τοποθέτηση σε δοκιμαστικό σωλήνα που περιέχει 5mL. Μετά από 5 λέπτα,λήψη με λαβίδα και τοποθέτηση σε δοκιμαστικό σωλήνα με 5mL.Επώαση στους 18 C για 24, 48 και 72 ώρες. o Για τα coupon που θα επωαστούν 48 ώρες,στις 24 ώρες θα γίνει λήψη του κάθε coupon με λαβίδα τοποθέτηση σε 5mL Ringer και έπειτα τοποθέτηση σε 5mL TSB.Συνέχιση επώασης για 24 ώρες στους 18 C.Η ίδια διαδικασία θα γίνει και στα coupon που θα επωαστουν για 48 κα 72 ώρες,μόνο που η ανανέωση θα γίνει στις 48 ώρες.

Επώαση στους 18˚C για 24, 48 και 72 ώρες

Πορεία πειράματος  Aπαρίθμηση προσκολλημένων και βιουμενικών κυττάρων Λήψη coupon με λαβίδα και ξέπλυμα με mL Ringer Τοποθέτηση του coupon σε άδειο σωληνάκι για 5 λεπτά Επανάληψη ξεπλύματος Τοποθέτηση του coupon σε falcon με 6ml Ringer και 10 γυάλινα σφαιρίδια (beads) Eντονος στροβιλισμός (vortexing) για 2 λεπτά Διαδοχικές αραιώσεις (λήψη ενός βακτηριακού εναιωρήματος και μεταφορά σε δοκιμαστικό σωλήνα με 9mL Ringer κοκ. Επώαση τρυβλίων για 24 ώρες στους 37 ˚C  Aπαρίθμηση προσκολλημένων και βιουμενικών κυττάρων Λήψη coupon με λαβίδα και ξέπλυμα με mL Ringer Τοποθέτηση του coupon σε άδειο σωληνάκι για 5 λεπτά Επανάληψη ξεπλύματος Τοποθέτηση του coupon σε falcon με 6ml Ringer και 10 γυάλινα σφαιρίδια (beads) Eντονος στροβιλισμός (vortexing) για 2 λεπτά Διαδοχικές αραιώσεις (λήψη ενός βακτηριακού εναιωρήματος και μεταφορά σε δοκιμαστικό σωλήνα με 9mL Ringer κοκ. Επώαση τρυβλίων για 24 ώρες στους 37 ˚C

Εντονος στροβιλισμός του coupon για 2 λεπτά με το μηχάνημα vortex.

Διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων-χρησιμοποιήσαμε πιπέτες των 100 και 1000μL,σωληνάκια με 9mL Ringer, tips και τρυβλία με TSA

Διαδικασία διαδοχικών αραιώσεων. Λήψη από το falcon (αριστερά) 1mL βακτ.εναιωρήματος και τοποθέτηση σε σωληνάκι με 9mL Ringer(δεξιά)

Τοποθέτηση στα τρυβλία 0.1mL βακτ.εναιωρήματος και επίστρωση.

Aπαρίθμηση αποικιών σε τρυβλιο με υλικό ανάπτυξης (TSA), έπειτα από επώαση για 24 ώρες στους 37.

Πιπέτες που χρησιμοποιηθηκαν Για τα ξεπλύματα και για τις διαδοχικές αραιώσεις

Μηχάνημα απαρίθμησης αποικιών σε τρυβλίο

Αποτελέσματα Στελέχη Β-137,Β-193,B-78,B-62 1)Εμβολιασμός κουπονιών (28-03) και επώασή τους για 24 και 48 ώρες. Στην πρώτη δειγματοληψία ( 24 ώρες επώαση) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την μηδενική την 1 και την 2 αραίωση. Για το κάθε στέλεχος κάναμε τρεις επαναλήψεις.Στην δεύτερη δειγματοληψία (48 ώρες επώαση ) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την 2, 3, και 4 αραίωση.Για το κάθε στέλεχος κάναμε πέντε επαναλήψεις. Α)Αποτελέσματα μετά από 24 ώρες Β-193 A(2): 5,92 log cfu/Cm 2 B(2): 5,63 log cfu/Cm 2 C(2): 4,83 log cfu/Cm 2 B-137 A(2): 5,01 log cfu/Cm 2 B(2): 6,05 log cfu/Cm 2 C(2): 5,96 log cfu/Cm 2 Στελέχη Β-137,Β-193,B-78,B-62 1)Εμβολιασμός κουπονιών (28-03) και επώασή τους για 24 και 48 ώρες. Στην πρώτη δειγματοληψία ( 24 ώρες επώαση) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την μηδενική την 1 και την 2 αραίωση. Για το κάθε στέλεχος κάναμε τρεις επαναλήψεις.Στην δεύτερη δειγματοληψία (48 ώρες επώαση ) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την 2, 3, και 4 αραίωση.Για το κάθε στέλεχος κάναμε πέντε επαναλήψεις. Α)Αποτελέσματα μετά από 24 ώρες Β-193 A(2): 5,92 log cfu/Cm 2 B(2): 5,63 log cfu/Cm 2 C(2): 4,83 log cfu/Cm 2 B-137 A(2): 5,01 log cfu/Cm 2 B(2): 6,05 log cfu/Cm 2 C(2): 5,96 log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα Β-78 A(2): 5,02 log cfu/Cm2 B(2): 5,03 log cfu/Cm2 C(2): 4,08 log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 4,90 log cfu/Cm2 B(2): 5,56 log cfu/Cm2 C(2): 5,90 log cfu/Cm2 Β-78 A(2): 5,02 log cfu/Cm2 B(2): 5,03 log cfu/Cm2 C(2): 4,08 log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 4,90 log cfu/Cm2 B(2): 5,56 log cfu/Cm2 C(2): 5,90 log cfu/Cm2

Αποτελέσματα Β)Αποτελέσματα μετά από 48 ώρες Β-193 A(2): 5,03log cfu/Cm 2 A(3): 4,97log cfu/Cm 2 B(2): 5,15log cfu/Cm 2 B(3): 5,00log cfu/Cm 2 C(2): 4,99log cfu/Cm 2 C(3): 4,70log cfu/Cm 2 D(2): 5,08log cfu/Cm 2 D(3): 4,91log cfu/Cm 2 E(2): 4,94log cfu/Cm 2 E(3): 4,81lof cfu/Cm 2 B-137 A(2): 4,70log cfu/Cm 2 A(3): 4,60log cfu/Cm 2 B(2): 5,46log cfu/Cm 2 B(3): 5,23log cfu/Cm 2 C(2): 5,22log cfu/Cm 2 C(3): 5,18log cfu/Cm 2 D(2): 5,32log cfu/Cm 2 D(3): 5,15log cfu/Cm 2 E(2): 5,16log cfu/Cm 2 E(3): 5log cfu/Cm 2 Β)Αποτελέσματα μετά από 48 ώρες Β-193 A(2): 5,03log cfu/Cm 2 A(3): 4,97log cfu/Cm 2 B(2): 5,15log cfu/Cm 2 B(3): 5,00log cfu/Cm 2 C(2): 4,99log cfu/Cm 2 C(3): 4,70log cfu/Cm 2 D(2): 5,08log cfu/Cm 2 D(3): 4,91log cfu/Cm 2 E(2): 4,94log cfu/Cm 2 E(3): 4,81lof cfu/Cm 2 B-137 A(2): 4,70log cfu/Cm 2 A(3): 4,60log cfu/Cm 2 B(2): 5,46log cfu/Cm 2 B(3): 5,23log cfu/Cm 2 C(2): 5,22log cfu/Cm 2 C(3): 5,18log cfu/Cm 2 D(2): 5,32log cfu/Cm 2 D(3): 5,15log cfu/Cm 2 E(2): 5,16log cfu/Cm 2 E(3): 5log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα Β-78 Α(2): 5,22log cfu/Cm2 A(3): 5,00log cfu/Cm2 B(2): 4,00log cfu/Cm2 C(2): 4,70log cfu/Cm2 C(3): 4log cfu/Cm2 D(2): 4,89log cfu/Cm2 D(3): 5,00log cfu/Cm2 E(2): 5,40log cfu/Cm2 E(3): 4,99log cfu/Cm2 F(2): 4,70log cfu/Cm2 F(3): 4,53log cfu/Cm2 G(2): 5,40log cfu/Cm2 G(3): 5,22 log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 4,70log cfu/Cm2 A(3): 4,31log cfu/Cm2 B(2): 5,26log cfu/Cm2 B(3): 5,60log cfu/Cm2 C(2): 5,00log cfu/Cm2 C(3): 5,10log cfu/Cm2 D(2): 5,89log cfu/Cm2 D(3): 5,95log cfu/Cm2 E(2): 6,40log cfu/Cm2 E(3): 6,16log cfu/Cm2 F(2): 5,50log cfu/Cm2 F(3): 5,73log cfu/Cm2 Β-78 Α(2): 5,22log cfu/Cm2 A(3): 5,00log cfu/Cm2 B(2): 4,00log cfu/Cm2 C(2): 4,70log cfu/Cm2 C(3): 4log cfu/Cm2 D(2): 4,89log cfu/Cm2 D(3): 5,00log cfu/Cm2 E(2): 5,40log cfu/Cm2 E(3): 4,99log cfu/Cm2 F(2): 4,70log cfu/Cm2 F(3): 4,53log cfu/Cm2 G(2): 5,40log cfu/Cm2 G(3): 5,22 log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 4,70log cfu/Cm2 A(3): 4,31log cfu/Cm2 B(2): 5,26log cfu/Cm2 B(3): 5,60log cfu/Cm2 C(2): 5,00log cfu/Cm2 C(3): 5,10log cfu/Cm2 D(2): 5,89log cfu/Cm2 D(3): 5,95log cfu/Cm2 E(2): 6,40log cfu/Cm2 E(3): 6,16log cfu/Cm2 F(2): 5,50log cfu/Cm2 F(3): 5,73log cfu/Cm2

Αποτελέσματα B)Εμβολιασμός κουπονιών (02-04) και επώασή τους για 48 και 72 ώρες Στην πρώτη δειγματοληψία ( 48 ώρες επώαση) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την την 2 την 3 και την 4 αραίωση. Για το κάθε στέλεχος κάναμε 7 επαναλήψεις.Στην δεύτερη δειγματοληψία (72 ώρες επώαση ) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την 2, 3, και 4 αραίωση.Για το κάθε στέλεχος κάναμε εξι επαναλήψεις. Α)Αποτελέσματα μετά από 48 ώρες Β-193 Α(2): 5,31log cfu/Cm 2 A(3): 5,14log cfu/Cm 2 B(2): 4,03log cfu/Cm 2 C(2): 4,94log cfu/Cm 2 C(3): 4log cfu/Cm 2 D(2): 4,93log cfu/Cm 2 D(3):4,90log cfu/Cm 2 E(2): 5,15log cfu/Cm 2 E(3): 4,97log cfu/Cm 2 F(2): 4,90log cfu/Cm 2 F(3): 4,73log cfu/Cm 2 G(2): 5,38log cfu/Cm 2 G(3): 5,10 log cfu/Cm 2 B)Εμβολιασμός κουπονιών (02-04) και επώασή τους για 48 και 72 ώρες Στην πρώτη δειγματοληψία ( 48 ώρες επώαση) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την την 2 την 3 και την 4 αραίωση. Για το κάθε στέλεχος κάναμε 7 επαναλήψεις.Στην δεύτερη δειγματοληψία (72 ώρες επώαση ) η επίστρωση των τρυβλίων έγινε από την 2, 3, και 4 αραίωση.Για το κάθε στέλεχος κάναμε εξι επαναλήψεις. Α)Αποτελέσματα μετά από 48 ώρες Β-193 Α(2): 5,31log cfu/Cm 2 A(3): 5,14log cfu/Cm 2 B(2): 4,03log cfu/Cm 2 C(2): 4,94log cfu/Cm 2 C(3): 4log cfu/Cm 2 D(2): 4,93log cfu/Cm 2 D(3):4,90log cfu/Cm 2 E(2): 5,15log cfu/Cm 2 E(3): 4,97log cfu/Cm 2 F(2): 4,90log cfu/Cm 2 F(3): 4,73log cfu/Cm 2 G(2): 5,38log cfu/Cm 2 G(3): 5,10 log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα B-137 A(2): 4,90log cfu/Cm 2 A(3): 4,51log cfu/Cm 2 B(2): 5,86log cfu/Cm 2 B(3): 5,70log cfu/Cm 2 C(2): 5,15log cfu/Cm 2 C(3): 5,13log cfu/Cm 2 D(2): 5,26log cfu/Cm 2 D(3): 5,15log cfu/Cm 2 E(2): 6,38log cfu/Cm 2 E(3): 6,06log cfu/Cm 2 F(2): 5,48log cfu/Cm 2 F(3): 5,43log cfu/Cm 2 Β-78 Α(2): 5,15log cfu/Cm 2 A(3): 4,48log cfu/Cm 2 B(2): 4,85log cfu/Cm 2 C(2): 5,34log cfu/Cm 2 C(3): 5,12log cfu/Cm 2 D(2): 4,93log cfu/Cm 2 D(3):4,72log cfu/Cm 2 E(2): 5,00log cfu/Cm 2 E(3): 4,38log cfu/Cm 2 F(2): 5,00log cfu/Cm 2 F(3): 4,55log cfu/Cm 2 G(2): 5,45log cfu/Cm 2 G(3): 5,23 log cfu/Cm 2 B-137 A(2): 4,90log cfu/Cm 2 A(3): 4,51log cfu/Cm 2 B(2): 5,86log cfu/Cm 2 B(3): 5,70log cfu/Cm 2 C(2): 5,15log cfu/Cm 2 C(3): 5,13log cfu/Cm 2 D(2): 5,26log cfu/Cm 2 D(3): 5,15log cfu/Cm 2 E(2): 6,38log cfu/Cm 2 E(3): 6,06log cfu/Cm 2 F(2): 5,48log cfu/Cm 2 F(3): 5,43log cfu/Cm 2 Β-78 Α(2): 5,15log cfu/Cm 2 A(3): 4,48log cfu/Cm 2 B(2): 4,85log cfu/Cm 2 C(2): 5,34log cfu/Cm 2 C(3): 5,12log cfu/Cm 2 D(2): 4,93log cfu/Cm 2 D(3):4,72log cfu/Cm 2 E(2): 5,00log cfu/Cm 2 E(3): 4,38log cfu/Cm 2 F(2): 5,00log cfu/Cm 2 F(3): 4,55log cfu/Cm 2 G(2): 5,45log cfu/Cm 2 G(3): 5,23 log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα Β-62 Α(2): 5,43log cfu/Cm 2 A(3): 5,28log cfu/Cm 2 B(2): 4,03log cfu/Cm 2 C(2): 5,19log cfu/Cm 2 C(3): 5log cfu/Cm 2 D(2): 5,86log cfu/Cm 2 D(3):4,80log cfu/Cm 2 E(2): 5,37log cfu/Cm 2 E(3): 4,00log cfu/Cm 2 F(2): 4,20log cfu/Cm 2 F(3): 4,13log cfu/Cm 2 G(2): 5,88log cfu/Cm 2 G(3): 5,23 log cfu/Cm 2 Β-62 Α(2): 5,43log cfu/Cm 2 A(3): 5,28log cfu/Cm 2 B(2): 4,03log cfu/Cm 2 C(2): 5,19log cfu/Cm 2 C(3): 5log cfu/Cm 2 D(2): 5,86log cfu/Cm 2 D(3):4,80log cfu/Cm 2 E(2): 5,37log cfu/Cm 2 E(3): 4,00log cfu/Cm 2 F(2): 4,20log cfu/Cm 2 F(3): 4,13log cfu/Cm 2 G(2): 5,88log cfu/Cm 2 G(3): 5,23 log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα B)Αποτελέσματα μετά από 72 ώρες Β-193 A(2): 4,87log cfu/Cm 2 B(2): 5,65log cfu/Cm 2 B(3): 5,73log cfu/Cm 2 C(2): 6,19log cfu/Cm 2 C(3): 5,71log cfu/Cm 2 D(2): 4,90log cfu/Cm 2 E(2): 4,72log cfu/Cm 2 F(2): 5,32log cfu/ F(3): 4,24log cfu/Cm 2 G(2): 4,84log cfu/Cm 2 B)Αποτελέσματα μετά από 72 ώρες Β-193 A(2): 4,87log cfu/Cm 2 B(2): 5,65log cfu/Cm 2 B(3): 5,73log cfu/Cm 2 C(2): 6,19log cfu/Cm 2 C(3): 5,71log cfu/Cm 2 D(2): 4,90log cfu/Cm 2 E(2): 4,72log cfu/Cm 2 F(2): 5,32log cfu/ F(3): 4,24log cfu/Cm 2 G(2): 4,84log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα B-137 A(2): 6,04log cfu/Cm 2 A(3): 5,65log cfu/Cm 2 B(2): 5,42log cfu/Cm 2 B(3): 4,48log cfu/Cm 2 C(2): 5,25log cfu/Cm 2 D(2): 5,90log cfu/Cm 2 D(3): 5,42log cfu/Cm 2 E(2): 6,26log cfu/Cm 2 E(3): 5,58log cfu/Cm 2 F(2): 5,28log cfu/Cm 2 B-137 A(2): 6,04log cfu/Cm 2 A(3): 5,65log cfu/Cm 2 B(2): 5,42log cfu/Cm 2 B(3): 4,48log cfu/Cm 2 C(2): 5,25log cfu/Cm 2 D(2): 5,90log cfu/Cm 2 D(3): 5,42log cfu/Cm 2 E(2): 6,26log cfu/Cm 2 E(3): 5,58log cfu/Cm 2 F(2): 5,28log cfu/Cm 2

Αποτελέσματα Β-78 A(2): 5,00log cfu/Cm2 B(2): 5,35log cfu/Cm2 B(3): 5,53log cfu/Cm2 C(2): 6,09log cfu/Cm2 C(3): 5,70log cfu/Cm2 D(2): 4,20log cfu/Cm2 E(2): 4,62log cfu/Cm2 F(2): 5,05log cfu/ F(3): 4,20log cfu/Cm2 G(2): 4,04log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 5,04log cfu/Cm2 A(3): 5,75log cfu/Cm2 B(2): 5,32log cfu/Cm2 B(3): 4,70log cfu/Cm2 C(2): 5,25log cfu/Cm2 D(2): 5,60log cfu/Cm2 D(3): 5,55log cfu/Cm2 E(2): 6,06log cfu/Cm2 E(3): 5,78log cfu/Cm2 F(2): 5,58log cfu/Cm2 Β-78 A(2): 5,00log cfu/Cm2 B(2): 5,35log cfu/Cm2 B(3): 5,53log cfu/Cm2 C(2): 6,09log cfu/Cm2 C(3): 5,70log cfu/Cm2 D(2): 4,20log cfu/Cm2 E(2): 4,62log cfu/Cm2 F(2): 5,05log cfu/ F(3): 4,20log cfu/Cm2 G(2): 4,04log cfu/Cm2 Β-62 A(2): 5,04log cfu/Cm2 A(3): 5,75log cfu/Cm2 B(2): 5,32log cfu/Cm2 B(3): 4,70log cfu/Cm2 C(2): 5,25log cfu/Cm2 D(2): 5,60log cfu/Cm2 D(3): 5,55log cfu/Cm2 E(2): 6,06log cfu/Cm2 E(3): 5,78log cfu/Cm2 F(2): 5,58log cfu/Cm2

ΕΥΧΑΡΙΣΤΟΥΜΕ! Παύλος Λουγκοβόης Χριστίνα Μολφέτα Τμήμα ΕΤΤ, Εργαστήριο Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων Ευστάθιος Πανάγου