ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΚΑ ΧΑΡΑΚΤΗΡΙΣΤΗΚΑ ΓΑΛΑΚΤΟΣ ΟΝΟΥ ΠΡΑΚΤΙΚΗ ΑΣΚΗΣΗ ΦΟΙΤΗΤΡΙΑΣ: ΜΠΙΤΣΗ ΝΕΦΕΛΗ ΤΜΗΜΑΤΟΣ : ΕΠΙΣΤΗΜΗΣ ΖΩΙΚΗΣ ΠΑΡΑΓΩΓΗΣ ΚΑΙ ΥΔΑΤΟΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΩΝ

Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η ταυτοποίηση καλλιεργειών από γάλα Όνου

ΕΙΣΑΓΩΓΗ-ΓΕΝΙΚΑ ΣΤΟΙΧΕΙΑ O γάιδαρος, γάδαρος ή γαϊδούρι, στο θηλυκό γένος γαϊδάρα, γαδάρα ή γαϊδούρα και στην καθαρεύουσα όνος, είναι κατοικίδιο εξημερωμένο θηλαστικό ζώο που ανήκει στην τάξη περισσοδάκτυλα. Η επιστημονική του ονομασία είναι Equus asinus, είναι δηλαδή ένα είδος του γένους «άλογο» (Ίππος - Equus). Πρόκειται για ζώο που φημίζεται για την παροιμιώδη υπομονή του. Αποτελεί επίσης σύμβολο ταπεινότητας.

ΚΑΤΑΝΟΜΗ TOY ZΩΪΚΟΥ ΚΕΦΑΛΑΙΟΥ ΟΝΩΝ ΣΕ ΠΑΓΚΟΣΜΙΟ ΕΠΙΠΕΔΟ ΠΕΡΙΟΧΗΠΛΗΘΥΣΜΟΣ%ΦΥΛΕΣ Αφρική26,926 Ασία - Ειρηνικός37,632 Ευρώπη - Καύκασος3,751 Λατ. Αμερική - Καραϊβική 19,924 Μέση Ανατολή11,847 Βορ. Αμερική0,15 Σήμερα ο όνος συναντάται στα περισσότερα μέρη του κόσμου, ανάλογης φυλετικής ποικιλότητας, με το μεγαλύτερο πληθυσμό στην Κίνα (8,5 εκατ.), στις βόρειες χώρες της Λατινικής Αμερικής, στο Μεξικό, στις χώρες της Μέσης Ανατολής (με έντονη παρουσία στην Τουρκία), σε όλη την Αφρικανική ήπειρο και από τον Ευρωπαϊκό χώρο στην Πορτογαλία, Ισπανία, Αλβανία και Βουλγαρία.

Ο ΟΝΟΣ ΣΤΟΝ ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΧΩΡΟ Στην Ελλάδα συνολικός πληθυσμός των όνων και ημίονων φθίνει ανησυχητικά τα τελευταία χρόνια. Ενδεικτικά αναφέρεται ότι το 1955 υπήρχαν άτομα, το , και το 2006 κατεγράφησαν μόλις άτομα. Γεωγραφικά οι όνοι και οι ημίονοι κατατάσσονται κυρίως σε ορεινές περιοχές όπου το ανάγλυφο του εδάφους είναι δύσβατο και τραχύ, και η παρουσία μηχανοκίνητων οχημάτων είναι προβληματική. Ειδικότερα αναφέρεται ότι το 2008 υπήρχαν στον ελλαδικό χώρο όνοι (ΥΑΑΤ 2008), με την μεγαλύτερη συγκέντρωση στην Πελοπόννησο και τη μικρότερη στα νησιά του Ιονίου. Στην χώρα μας οι όνοι διατηρούνται από εκτροφείς μεγάλης ηλικίας, για συναισθηματικούς κυρίως λόγους (γράφημα 1.2). Αυτό αποτελεί δυσάρεστο γεγονός, καθώς αποδεικνύει ότι οι νεότερες ηλικίες τα τελευταία χρόνια δε δείχνουν κανένα ενδιαφέρον για την διατήρηση αυτού του ζώου.

ΠεριοχήΑριθμός όνων Θράκη852 Μακεδονία1725 Θεσσαλία801 Ήπειρος1138 Στερεά Ελλάδα1921 Πελοπόννησος4436 Νησιά Αιγαίου1735 Κρήτη1676 Νησιά Ιονίου286 Σύνολο14570 Κατανομή όνων και ημίονων ανά γεωγραφικό διαμέρισμα, έτος 2000 (πηγή: Σ.Υ.Ε )

ΤΟ ΓΑΛΑ ΤΗΣ ΟΝΟΥ Το γάλα αποτελεί υγρό έκκριμα των θηλαστικών, για τη θρέψη των απογόνων τους. Προσφέρει στο νεογέννητο, όλα τα θρεπτικά συστατικά που χρειάζεται για την ανάπτυξή του και βοηθά στην ολοκλήρωση των φυσιολογικών λειτουργιών του οργανισμού. Περιέχει ανοσοσφαιρίνες που έχουν προστατευτική δράση, διάφορους αντιβακτηριακούς παράγοντες, βοηθητικά πέψης όπως ένζυμα και ενζυμικούς αναστολείς (που δεσμεύουν ή μεταφέρουν πρωτεΐνες) και αυξητικούς παράγοντες και ορμόνες (Fox, 2003). Το γάλα, έχει θεμελιώδη θρεπτική σημασία για τα νεογέννητα. Πιο συγκεκριμένα η σύστασή του γάλακτος όνου: Νερό % Πρωτεΐνες % Λίπος %Λακτόζη % Καζεΐνη % Ενέργεια Kj/kg Γάλα όνου 91,21,721,06,90, Τα τελευταία χρόνια, έχει αυξηθεί το ενδιαφέρον που προσανατολίζεται στο γάλα της γαϊδούρας λόγω της σύστασής του, καθώς όπως έχει διαπιστωθεί, βρίσκεται πολύ κοντά σε αυτή του ανθρώπινου γάλακτος. Η εμφάνιση αλλεργιών, στο αγελαδινό γάλα, από νεαρά άτομα, έχει στρέψει το ενδιαφέρον στην κατανάλωση γάλακτος γαϊδούρας.

Ως διάρκεια γαλακτικής περιόδου ορίζεται το χρονικό διάστημα από την έναρξη της παραγωγής γάλακτος ( τοκετός) μέχρι την στιγμή όπου η γαλακτοπαραγωγή είναι τόσο μικρή ώστε κρίνεται σκόπιμο η διακοπή της. Η συνολική ποσότητα γάλακτος που παράγεται σ’ αυτό το χρονικό διάστημα αποτελεί την ποσότητα της γαλακτοπαραγωγής Η γαλακτική περίοδος στον όνο κυμαίνεται περίπου στις ημέρες (φυλή Ragusana), και με δεδομένο ότι ο πώλος θηλάζει τουλάχιστον ένα μήνα η συλλογή του εμπορεύσιμου γάλακτος να φτάσει το πολύ στους 5 μήνες. Η συνολική όμως ποσότητα ανέρχεται στα kg (με 2 έως 3 αρμέγματα την ημέρα), αρκετά χαμηλή για το μέγεθος του ζώου. Εντούτοις πειραματικά έχει αποδειχθεί ότι με 8 αρμέγματα την ημέρα (πρακτικά αδύνατο σε επίπεδο εκτροφής) η συνολική γαλακτοπαραγωγή μπορεί να φτάσει στα 750 kg. (M. Alabiso, 2004). Όπως παρατηρείται η ποσότητα γάλακτος αυξάνει ανάλογα με τον αριθμό των αρμεγμάτων. Σε αυτή την περίπτωση το επίπεδο λίπους είναι χαμηλό, πράγμα επιθυμητό, αφού σήμερα το ποσοστό των κορεσμένων λιπαρών οξέων επιβαρύνει τις καρδιαγγειακές παθήσεις. Κατά τη διάρκεια της γαλακτοπαραγωγής στο 1 ο στάδιο παρατηρείται μεγαλύτερη παραγωγή σε σχέση με το 2 ο και το 3 ο. ΓΑΛΑΚΤΟΠΑΡΑΓΩΓΗ

Τυπική καμπύλη γαλακτοπαραγωγής

Σύντομη αναφορά στην εργασία της κ. Θεοδοσίου Ιωάννας στα πλαίσια της μεταπτυχιακής της εργασίας με θέμα: «Συνθήκες παραγωγής και Χαρακτηριστικά γάλακτος Όνου». Σε διάστημα τριών μηνών (Νοέμβριος-Φεβρουάριος) έγιναν συνολικά τέσσερις δειγματοληψίες, από ζώα, ευρισκόμενα σε διαφορετικά στάδια της γαλακτικής περιόδου, σε εκτροφή ευρισκόμενη στη περιοχή του Αργους. Στα συλλεγέντα δείγματα, μελετήθηκαν στοιχεία της χημικής σύστασής τους και μικροβιολογικές ομάδες προσδιοριστικές της μικροβιακής ποιότητας των δειγμάτων, όπως: H Ολική Μεσόφιλη Χλωρίδα, τα Οξυγαλακτικά βακτήρια, οι Λακτόκοκκοι, οι Εντερόκοκκοι, τα Ψυχρότροφα βακτήρια, οι Μικρόκοκκοι, τα Κολοβακτήρια, οι Ζύμες-μύκητες και τα Θερμοανθεκτικά βακτήρια. Από τα υποστρώματα ανάπτυξης και αρίθμησης των παραπάνω μελετηθέντων ομάδων, κρατήθηκαν επιλεκτικά 85 αποικίες και διατηρήθηκαν σε Vials ( γάλα 10%, με γλυκερόλη 15%)στην κατάψυξη στους (-80 ο C). Η μελέτη και ο χαρακτηρισμός αυτών των καλλιεργειών θα αποτελέσει το αντικείμενο μελέτης της συγκεκριμένης εργασίας. Περιγραφή της μεταπτυχιακής εργασίας

ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΟ ΜΕΡΟΣ Προκαταρκτική ταυτοποίηση μικροοργανισμών: Δοκιμές: 1.Xρώση Gram, 2.Δοκιμή καταλάσης, 3.Έλεγχος ανάπτυξης σε διαφορετικές θερμοκρασίες ( Kόκκοι:10 0 C, 45 0 C – Bάκιλλοι:15 ο C, 45 0C), 4. Έλεγχος παραγωγής CO 2 5. Έλεγχος ανάπτυξης σε μέσο με pH 9,6).. Με βάση τις παραπάνω δοκιμές θα γίνει ομαδοποίηση των υπό μελέτη καλλιεργειών και αντιπροσωπευτικά θα εφαρμόσουμε, 6. Δοκιμή μελέτης της ζυμωτικής ικανότητος των καλλιεργειών και 7. Απομόνωση DNA (DNA extraction) και εφαρμογή μεθόδων μοριακής ταυτοποίησης

Στα πλαίσια της πρακτικής άσκησης διεξήχθη: Ο καθαρισμός των καλλιεργειών και Η μελέτη της συμπεριφοράς των μικροοργανισμών στη χρώση Gram.

Συνοπτική Παρουσίαση της διαδικασίας καθαρισμού των μικροοργανισμών…..: Από Vial (-80 0 C) που πιθανά σε κάθε vial υπάρχουν περισσότερα από ένα είδη μικροοργανισμών….. Σε Vial (-80 0 C) Όπου,σε κάθε vial να υπάρχει μόνο ένα είδος μικροοργανισμού Η διαδικασία ολοκληρώνεται σε 5 στάδια: (διαφ.19- διαφ.22)

1. Εμβολιασμός σε nutrien broth και επώαση στους 30 ο C Over night 2. Μικροσκοπική απεικόνηση σε αντικειμενοφόρο πλάκα με τη μέθοδο χρώσης κατά Gram Streaking Επώαση για 48h στους 30 ο C Streaking Επώαση για 48h στους 30 ο C 5. Εμβολιασμός αποικίας σε Broth επώαση Over nightστους 30 ο C 6. Μικροσκοπική παρατήρηση- Έλεγχος καθαρότητας των βακτηρίων 7. Εμβολιασμός σε vial με broth με γλυκερόλη συντήρηση στους ( -80 ο C) ΣΧΕΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΗΣΗ KAΘΑΡΙΣΜΟΥ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ

ΥΛΙΚΑ ΠΟΥ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΗΘΗΚΑΝ Α. Για τη χρώση κατά Gram: κρυσταλλικό ιώδες- Crystal violet, δ.ιωδίου-Lugol, σαφρανίνη-Safranine και Aιθυλική αλκοόλη «οινόπνευμα». Β. Θρεπτικά υλικά και υποστρώματα: M-17 broth, MRS broth, Nutrient broth, Γλυκερόλη, Agar Bacteriological Type E Η Παρασκευή των θρεπτικών υποστρωμάτων γίνεται σύμφωνα με τις αναγραφόμενες οδηγίες Συσκευή υγρής αποστείρωσης - Αutoclave (121 0 C, 1,2 Atm) Oλα τα θρεπτικά υλικά πριν τη χρήση τους αποστειρώνονται.

ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ-ΤΕΧΝΙΚΕΣ Α. ΧΡΩΣΗ ΚΑΤA GRAM Aρχή μεθόδου: Είναι μια απλή μέθοδος η οποία κατατάσσει τα είδη των βακτηρίων σε δύο μεγάλες κατηγορίες,τα "θετικά και τα αρνητικά κατά Gram".βακτηρίων Τα κύτταρα των μικροοργανισμών λόγω της διαφορετικής σύστασης του κυτταρικού τοιχώματος συμπεριφέρονται διαφορετικά στην επίδραση των αντιδραστηρίων της χρώσης Gram, με αποτέλεσμα άλλα να βάφονται με χρώμα πορφυροϊώδες και άλλα κόκκινα. Τα αντιδραστήρια Η διαδικασία

Περιγραφή Τεχνικής: Σε αντικειμενοφόρο πλάκα, Μεταφέρουμε με αποστειρωμένο βακτηριολογικό κρίκο δείγμα από την υπό εξέταση καλλιέργεια. Προσηλώνουμε σε λύχνο, Χρωματίζουμε το παρασκεύασμα με Crystal violet. Η χρωστική παραμένει για 1 λεπτό, Ξεπλένουμε με νερό, Προσθέτουμε δ. ιωδίου. Παραμένει για 1 λεπτό, Ξεπλένουμε με οινόπνευμα και εν συνεχεία με νερό, Προσθέτουμε τη χρωστική σαφρανίνη. Παραμένει για 1 λεπτό και στη συνέχεια ξεπλένουμε την περίσσεια της με νερό. Στεγνώνουμε, με απορροφητικό χαρτί χωρίς αυτό να σύρεται στην επιφάνεια της πλάκας. Ακολουθεί μικροσκοπική παρατήρηση με ελαιοκαταδυτικό φακό (μεγέθυνση x100 )

Β. Τεχνική καθαρισμού μικροοργανισμών με παράλληλες γραμμές σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (streaking) Ποσότητα εναιωρήματος ή στερεής καλλιέργειας μικροοργανισμών μεταφέρεται με τη βοήθεια του κρίκου εμβολιασμού, σε σημείο του τρυβλίου κοντά στο τοίχωμα και εξαπλώνεται σε παράλληλες γραμμές. Ακολουθεί διασπορά των μικροοργανισμών σε όλη την επιφάνεια του τρυβλίου σύροντας τον κρίκο πάνω στο θρεπτικό υπόστρωμα διαγράφοντας ελικοειδείς παράλληλες γραμμές, όπως φαίνεται στην παρακάτω εικόνα. Χρησιμοποιείται όλη η επιφάνεια του τρυβλίου με αποτέλεσμα την αραίωση και τον διαχωρισμό των κυττάρων, έτσι ώστε το κάθε κύτταρο να δίνει μια απομονωμένη αποικία. Απομονωμένη αποικία

ΠΟΡΕΙΑ ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΥ ΜΙΚΡΟΟΡΓΑΝΙΣΜΩΝ Κάθε καλλιέργεια μεταφέρεται από το vial των (-80 0 C) σε δοκιμαστικό σωλήνα με 5ml Nutrien Broth και επωάζεται σε κλίβανο των 30 ο C, over night Την επόμενη μέρα ελέγχουμε μακροσκοπικά την ανάπτυξη, (δημιουργία θολώματος) και κάνουμε μικροσκοπική παρατήρηση, με τη βοήθεια της χρώσης Gram Παρατηρούμε τη μορφολογία των κυττάρων και εάν είναι κόκκοι κάνουμε streaking σε τρυβλίο με Μ- 17 Agar, εάν είναι βάκιλλοι σε τρυβλίο με MRS Agar. Σε περίπτωση που παρατηρούμε κύτταρα ζύμης εξαπλώνουμε σε τρυβλίο με Nutrient Agar. Τοποθετούμε τα τρυβλία στον κλίβανο των 30 ο C ανεστραμμένα και τα επωάζουμε για 48 ώρες

Μετά την επώαση των 48 ωρών κάνουμε δεύτερο streaking ακολουθώντας την ίδια διαδικασία Βακτηριολογικός κρίκος Παράδειγμα ανάπτυξης, 2 διαφορετικών αποικιών 1 ο είδος αποικίας 2 ο είδος αποικίας Στη συνέχεια τα τρυβλία τοποθετούνται σε κλίβανο των 30 ο C για άλλες 48 ώρες.

Μετά τη διαδικασία αυτή εμβολιάζουμε μια μόνο αποικία (single colony Isolation) σε δοκιμαστικό σωλήνα με 5 ml M-17(κόκκοι) ή MRS Broth(βάκιλλοι) και επωάζουμε σε κλίβανο 30 ο C, over night. Μεταφορά αποικίας σε BrothΕπώαση σε κλίβανο 30 ο C

Επαναλαμβάνουμε μικροσκοπική παρατήρηση με τη μέθοδο χρώσης κατά Gram για να ελέγξουμε την καθαρότητα των μικροοργανισμών. Αν έχουμε μόνο κόκκους τοποθετούμε δείγμα από την τελευταία καλλιέργεια σε vial με M-17 και γλυκερόλη 15%, ενώ αν έχουμε βακίλους τους τοποθετούμε σε vial με MRS και γλυκερόλη 15%. Στην περίπτωση που έχουμε ζύμες τις μεταφέρουμε σε vial με Νutrien broth με γλυκερόλη 15% Έλεγχος ανάπτυξης- απαραίτητη η ανάδευση Τα Vials τα τοποθετούμε στην κατάψυξη στους -80 ο C. Στην περίπτωση που η μικροσκόπηση μας δείξει πάνω από ένα είδος μικροβίων επαναλαμβάνουμε τη διαδικασία streaking 3,4,..έως ότου απομονώσουμε για κάθε μικροοργανισμό ενός είδους αποικία

Εικόνες από Streaking

Gram(+) κόκκοι Gram (-) και (+) βάκιλοι Μικροσκοπικές παρατηρήσεις

ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ 85 Gram (+)Gram (-) Kόκκοι39354 Βάκιλλοι Ζύμες3

Απεικόνιση σε γράφημα των αποτελεσμάτων

ΕΥΧΑΡΙΣΤΙΕΣ Με την ολοκλήρωση της μέχρι τώρα εργασίας μου, θα ήθελα να ευχαριστήσω, τον κ. Μασούρα Θεοφύλακτο, Επίκουρο Καθηγητή του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας στο Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων για την εμπιστοσύνη που μου επέδειξε με την ανάθεση του συγκεκριμένου θέματος. Θα ήθελα επίσης να ευχαριστήσω την κ. Μανωλοπούλου Ευγενία, Ε.Ε.ΔΙ.Π. του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας, για την επίβλεψη και την αμέριστη βοήθειά της σε όλη τη διάρκεια της εργασίας μου.