Aπομόνωση DNA από φυτικά κύτταρα Επιμέλεια: Καπασά Μαρία Βιολόγος, MSc, PhD

Υλικά: Πάγος Μπανάνες Για το διάλυμα εκχύλισης του DNA (100 mL) Υγρό πιάτων (όχι συμπυκνωμένο) 10 mL Μαγειρικό αλάτι ¼ κουταλιού Απιονισμένο νερό 90 mL Για την απομόνωση του DNA Αιθανόλη 10 ml παγωμένη (-20 0 C) Σταγόνες διαλύματος πεψίνης 1%w/v ή 5-6 σταγόνες από υγρό φακών Ηθμός ή γάζα Σακουλάκι ή Γουδί Χωνί Δοκιμαστικός σωλήνας Ποτήρι ζέσεως (250 mL) Ογκομετρικός κύλινδρος (100 mL) Ξύλινος ή γυάλινος αναδευτήρας Πιπέτα Pasteur ή σύριγγα Όργανα κ Συσκευές (Για κάθε ομάδα):

Πολτοποιούμε το υλικό μας μέσα στο σακουλάκι ή στο γουδί. Μέσα στο ποτήρι ζέσεως ετοιμάζουμε το δ/μα εκχύλισης μετρώντας τους κατάλληλους όγκους με τον ογκομετρικό κύλινδρο. Εκτέλεση Πειράματος Βήμα 2 Προσθέτουμε περίπου 100mL διαλύματος εκχύλισης (ίση ποσότητα με το ομογενοποίημα) και πιέζουμε ελαφρά ώστε να αναμιχθούν Βήμα 1 Βήμα 3 Τοποθετούμε ένα χωνί σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα και βάζουμε μία γάζα/ηθμό μέσα στο χωνί. Ρίχνουμε το μίγμα του διαλύματος εκχύλισης, με το πολτοποιημένο υλικό μας, στον ηθμό και φιλτράρουμε το μίγμα μέσα στο σωλήνα Βήμα 4 Με τη βοήθεια της πιπέτας προσθέτουμε 2-3 σταγόνες διαλύματος του ενζύμου (πεψίνης), ανακατεύουμε ελαφρά και περιμένουμε λίγα λεπτά. Έπειτα προσθέτουμε σιγά σιγά την παγωμένη αλκοόλη στο διήθημα μέχρι να σχηματιστούν δύο διακριτές φάσεις. Κρατάμε το δοκιμαστικό σωλήνα ακίνητο και παρατηρούμε τις δύο φάσεις. Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες κινούνται στον πυθμένα της κάτω στοιβάδας, ενώ τα νουκλεϊκά οξέα ανέρχονται στην πάνω στοιβάδα της αλκοόλης Βήμα 5 Με τη βοήθεια της ράβδου “ψαρεύουμε” το DNA και το απομακρύνουμε από το δοκιμαστικό σωλήνα

Πολτοποιούμε το υλικό μας μέσα στο σακουλάκι ή στο γουδί. Εκτέλεση Πειράματος Βήμα 1 Βήμα 2 Προσθέτουμε περίπου 100mL διαλύματος εκχύλισης (ίση ποσότητα με το ομογενοποίημα) και πιέζουμε ελαφρά ώστε να αναμιχθούν.

Γιατί πολτοποιούμε την μπανάνα ; Ποιος ο ρόλος του απορυπαντικού στο διάλυμα εκχύλισης ; Μόρια Απορρυπαντικού Κυτταρικές μεμβράνες

Πυρήνας Κύτταρο Ινίδια Χρωματίνης Χρωμόσωμα Γιατί προσθέτουμε πρωτεïνάση στο διήθημα; Οκταμερές Ιστονών Νουκλεοσώματα

Εκτέλεση Πειράματος Βήμα 3 Τοποθετούμε ένα χωνί σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα και βάζουμε μία γάζα ή ηθμό μέσα στο χωνί. Ρίχνουμε το μίγμα του διαλύματος εκχύλισης με το πολτοποιημένο υλικό μας, στον ηθμό και φιλτράρουμε το μίγμα μέσα στο σωλήνα. Βήμα 4 Με τη βοήθεια της πιπέτας προσθέτουμε 2-3 σταγόνες διαλύματος του ενζύμου (πεψίνης), ή 5-6 σταγόνες από υγρό καθαρισμού φακών, ανακατεύουμε ελαφρά και περιμένουμε λίγα λεπτά. Έπειτα προσθέτουμε σιγά σιγά την παγωμένη αλκοόλη στο διήθημα μέχρι να σχηματιστούν δύο διακριτές φάσεις.

Κρατάμε το δοκιμαστικό σωλήνα ακίνητο και παρατηρούμε τις δύο φάσεις. Τα λιπίδια και οι πρωτεΐνες κινούνται στον πυθμένα της κάτω στοιβάδας, ενώ τα νουκλεϊκά οξέα ανέρχονται στη στοιβάδα της αλκοόλης (πάνω). Βήμα 5 Με τη βοήθεια της ράβδου “ψαρεύουμε” το DNA και το απομακρύνουμε από το δοκιμαστικό σωλήνα.

Εναλλακτικά… Απομόνωση DNA από επιθηλιακά κύτταρα ανθρώπου

Ερωτήσεις- Προβληματισμοί 1. Το παραπάνω πείραμα θα μπορούσε να γίνει χρησιμοποιώντας κάποιο άλλο υλικό π.χ ζωικό ιστό ή ακόμη και ανθρώπινο; Η εικόνα που θα παίρναμε θα ήταν διαφορετική; 2.Γιατί πολτοποιούμε την μπανάνα ; 3. Ποιος ο ρόλος του αλατιού και του απορρυπαντικού στο διάλυμα εκχύλισης; 4. Γιατί προσθέτουμε πεψίνη στο διήθημα; 5. Γιατί το DNA συλλέγεται στην φάση της αλκοόλης; 6. Το RNA συλλέγεται στην φάση της αλκοόλης; 7. Αν παρατηρήσουμε το DNA στο μικροσκόπιο θα δούμε την διπλοέλικα;

Παρατήρηση DNA Επισκευτείτε τη Βάση δεδομένων για κρυσταλλογραφικά λυμένες δομές βιομορίων Protein Data Bank (PDB) στο διαδίκτυο. Αναζητήστε δομές που περιέχουν και τη διπλοέλικα DNA κρυσταλωμένη π.χ. τη δομή με κωδικό 2LEF Με τη βοήθεια ενός προγράμματος απεικόνισης βιομορίων π.χ. Jmol παρατηρείστε τη δομή. Ανοίξτε το αντίστοιχο αρχείο με τις συντεταγμένες των ατόμων του μορίου στο χώρο και διαβάστε το.

Αρχείο 2LEF >2LEF:A|PDBID|CHAIN|SEQUENCEMHIKKPLNAFMLYMKEMRANVVAESTLKESAAINQILGRRWHALSREEQAKYYELARKERQLHMQLYPGWSARD NYGKKKKRKREK >2LEF:B|PDBID|CHAIN|SEQUENCECACCCTTTGAAGCTC >2LEF:C|PDBID|CHAIN|SEQUENCEGAGCTTCAAAGGGTG … …