ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ FLOW CYTOMETRY

Παρουσίαση με θέμα: "ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ FLOW CYTOMETRY"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ FLOW CYTOMETRY
Κ. Ε. ΜΑΝΩΛΟΠΟΥΛΟΣ Χ. ΑΝΤΖΟΥ-ΑΓΓΟΥΡΙΔΑΚΗ

2 ΔΟΜΗ ΚΑΙ ΚΥΤΤΑΡΑ ΤΟΥ ΑΝΟΣΙΑΚΟΥ ΣΥΣΤΗΜΑΤΟΣ

3 Το ανοσιακό σύστημα αποτελεί το βασικό αμυντικό σύστημα του ανθρώπου Η οργάνωση και η λειτουργία του είναι πολύπλοκη

4 Η ανοσιακή απάντηση επιτυγχάνεται από τη συγχρονισμένη λειτουργία διαφόρων κυττάρων καθώς και από διαλυτά μόρια που αυτά εκκρίνουν Λεμφοκύτταρα Φαγοκύτταρα Αντισώματα Κυτταροκίνες Συμπλήρωμα Παράγοντες φλεγμονής

5 Τα λεμφοκύτταρα τα φαγοκύτταρα και τα επικουρικά κύτταρα προέρχονται από το κοινό πρόδρομο αρχέγονο κύτταρο (ύπαρξη του CD34+ επιφανειακού αντιγόνου)

6

7 Ανατομική και λειτουργική διαίρεση του ανοσιακού συστήματος
Πρωτογενή λεμφικά όργανα (λεμφογένεση, Θύμος αδένας, εμβρυικό ήπαρ και μυελός των οστών ενηλίκων ) Δευτερογενή λεμφικά όργανα (λεμφαδένες και σπλήνας) Εξωλεμφαδενικούς τριτογενείς ιστούς

8 Οι τρεις αυτοί τύποι λεμφικού ιστού συνδέονται μεταξύ τους χάρις στην συνεχή ανακυκλοφορία των λεμφοκυττάρων

9 Τα Λεμφοκύτταρα Στον φυσιολογικό ανθρώπινο οργανισμό ανευρίσκονται περισσότερα από 1012 λεμφοκύτταρα Είναι κύτταρα μικρά στρογγυλά διαμέτρου 5-12μm με σφαιρικό πυρήνα Το κυτταρόπλασμα τους περιέχει μιτοχόνδρια και ελεύθερα ριβοσωμάτια

10 Τα Λεμφοκύτταρα διαιρούνται σε δύο μεγάλες κατηγορίες κυττάρων
Τ κύτταρα Διαφοροποιούνται και ωριμάζουν στον θύμο αδένα Β κύτταρα Διαφοροποιούνται και ωριμάζουν στο εμβρυικό ήπαρ και στο μυελό των οστών των ενηλίκων

11 Υπάρχει όμως και τρίτος κυτταρικός πληθυσμός και ονομάζεται φυσικά κύτταρα φονείς -Natural killer cells, NK- και δρουν χωρίς προηγούμενη κυτταρική ευαισθητοποίηση

12 Τα Λεμφοκύτταρα εμφανίζουν στην επιφάνεια τους ένα μεγάλο αριθμό διαφορετικών πρωτεϊνικών μορίων που μπορεί να χρησιμοποιηθούν ως διακριτοί δείκτες μεταξύ των κυτταρικών πληθυσμών

13 Αυτοί οι ειδικοί δείκτες καλούνται αντιγόνα (αντιγόνα επιφανείας) γιατί ανιχνεύονται με τη χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων

14 Ο επιφανειακός δείκτης που χαρακτηρίζει επακριβώς μια κυτταρική σειρά ή ένα στάδιο διαφοροποίησης, έχει καθοριστική δομή και αναγνωρίζεται από μια ομάδα -cluster- μονοκλωνικών αντισωμάτων, ονομάζεται μέλος ομάδας διαφοροποίησης, Cluster of Differentiation

15 Τα χαρακτηριστικά αυτά αντιγόνα ονομάζονται δείκτες επιφανείας ή αντιγόνα διαφοροποίησης και αναφέρονται με τον όρο CD και ένα αριθμητικό προσδιορισμό όπως CD1, CD2 κλπ.

16 Τ λεμφοκύτταρα Αποτελούν το 80-85% των περιφερικών λεμφοκυττάρων
Τ λεμφοκύτταρα Αποτελούν το 80-85% των περιφερικών λεμφοκυττάρων Δεν εμφανίζουν στην επιφάνεια τους ανοσοσφαιρίνες Σχηματίζουν αυτόματα ροζέτες με τα ερυθροκύτταρα προβάτου (ύπαρξη του CD2 επιφανειακού αντιγόνου) Μαζί με τα μακροφάγα συμμετέχουν στην ανοσιακή απάντηση

17 (συνέχεια) Η αναγνώριση του αντιγόνου γίνεται με τον υποδοχέα TCR
Έχουν προσδιοριστεί δυο τύποι υποδοχέων, ο TCR-1 και ο TCR-2 Το 85-90% των κυττάρων του περιφερικού αίματος εμφανίζει τον TCR-2 ενώ το 15% εμφανίζει τον TCR-1 Οι υποδοχείς αυτοί αναγνωρίζουν αντιγόνα μόνον όταν αυτά συμπαρουσιάζονται από τα κύτταρα που παρουσιάζουν τα αντιγόνα (APC κύτταρα) μαζί με γλυκοπρωτεΐνες της Ι ή ΙΙ MHC τάξης (πρωτεΐνες του μείζονος συστήματος ιστοσυμβατότητας)

18 (συνέχεια) Τα TCR-2+ κύτταρα υποδιαιρούνται σε δυο υποπληθυσμούς
Σε αυτά που φέρουν τον CD4 δείκτη και βοηθούν ή προτρέπουν τη ανοσολογική απάντηση (βοηθητικά ΤΗ) Και σε αυτά που φέρουν τον CD8 δείκτη και έχουν κυτταροτοξική-κατασταλτική δράση (κυτταροτοξικά Tc) Τα CD4+ κύτταρα αναγνωρίζουν αντιγόνα σε συνδυασμό με τα μόρια της τάξης ΙΙ του MHC ενώ τα CD8+ σε συνδυασμό με τα μόρια της τάξης Ι του MHC Το CD3 επιφανειακό αντιγόνο είναι ο χαρακτηριστικός δείκτης όλων των Τ κυττάρων

19

20

21

22 B λεμφοκύτταρα Αποτελούν το 10-15% των περιφερικών λεμφοκυττάρων
Οι χαρακτηριστικοί δείκτες της Β λεμφοκυτταρικής σειράς είναι οι ενδογενώς παραγόμενες ανοσοσφαιρίνες που δρουν ως υποδοχείς της κυτταρικής επιφάνειας (αντιγονικοί υποδοχείς) Η πλειονότητα των ανθρωπίνων Β-κυττάρων στο περιφερικό αίμα εκφράζει δυο ισότυπους ανοσοσφαιρινών στην επιφάνεια τους, τις IgM και IgD

23 (συνέχεια) Κάθε Β (όπως και κάθε Τ-κύτταρο) αναγνωρίζει ειδικά ένα συγκεκριμένο αντιγόνο Με την αναγνώριση το Β λεμφοκύτταρο διαιρείται και διαφοροποιείται σε πλασματοκύτταρο

24 (συνέχεια) Η πλειονότης των Β-κυττάρων φέρει MHC αντιγόνα ΙΙ τάξης που παίζουν σπουδαίο ρόλο στη συνεργασία με τα Τ-κύτταρα Το CD19 αντιγόνο ανευρίσκεται επί όλων των Β-κυττάρων εκτός των πλασματοκυττάρων Το CD20 εμφανίζεται πρώτο κατά τα αρχικά στάδια της ωρίμανσης των Β-κυττάρων και εξαφανίζεται κατά την διαφοροποίηση τους σε πλασματοκύτταρα Το CD22 αντιγόνο ανευρίσκεται στο 50% των προ-Β κυττάρων, στο 75% των Β-κυττάρων καθώς και σε μικρό ποσοστό των ενεργοποιημένων Β-κυττάρων

25

26

27 Φυσικά κύτταρα φονείς ΝΚ
Φυσικά κύτταρα φονείς ΝΚ Αποτελούν το 15% των περιφερικών λεμφοκυττάρων του αίματος και το 3-4% των σπληνικών λεμφοκυττάρων Έχουν κυτταροπλασματικά κοκκία που χαρακτηρίζονται για την ικανότητα τους να σκοτώνουν ορισμένα καρκινικά κύτταρα καθώς και κύτταρα που έχουν μολυνθεί από ιούς Επί της επιφανείας τους εμφανίζουν διαφόρους κυτταρικούς δείκτες όπως τον CD16, τον CD56, τον CD58 καθώς και τον υποδοχέα για την β αλυσίδα της IL-2

28 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ FLOW CYTOMETRY

29 Εισαγωγή Οι πρώτες μελέτες για αναλυτές Κυτταρομετρίας Ροής έγιναν το 1934 από τον Moldavan και συνεχίστηκαν με τις εργασίες του W.Coulter Οι πρώτες εφαρμογές της Κυτταρομετρίας Ροής στην ιατρική άρχισαν την δεκαετία του ΄60 απο τους Kamentsky και Fulwyler Η ανακάλυψη των μονοκλωνικών αντισωμάτων (Nobel 1984 στους Kohler και Milstein) άνοιξε το δρόμο στη σύγχρονη Κυτταρομετρία Ροής που διεύρυνε σημαντικά το πεδίο των κλινικών εφαρμογών

30 Γενικά χαρακτηριστικά
Γενικά χαρακτηριστικά Η Κυτταρομετρία Ροής είναι μια τεχνική που εκμεταλλεύεται την μέτρηση ορισμένων βιοχημικών και βιοφυσικών παραμέτρων των κυττάρων μεμονωμένα, όταν αυτά βρίσκονται σε εναιώρημα εντός υγρού που ρέει σε νηματοειδή ροή Η ανάλυση αυτή μπορεί να αφορά το μέγεθος, τον όγκο, την κοκκίωση, καθώς και χημικές ιδιότητες όπως την περιεκτικότητα σε DNA και RNA, πρωτεΐνες και ένζυμα. Κυτταρικά επιφανειακά μόρια μπορούν ευκρινώς να ανιχνευθούν με ανοσοφθορισμό με την χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων

31 Η ανίχνευση αυτών των παραμέτρων επιτυγχάνεται με την μέτρηση της σκέδασης του φωτός, με την ανίχνευση του όγκου των κυττάρων και με τη μέτρηση της έντασης του φθορισμού

32

33 Προέκταση της τεχνολογίας αυτής αποτελεί ο κυτταροδιαχωρισμός ροής, κατά τον οποίο οποιοδήποτε μεμονωμένο κύτταρο, οργανίδιο κτλ., που προσδιορίζεται όπως παραπάνω, μπορεί επιλεκτικά να απομακρυνθεί από το εναιώρημα με βάση τις μετρήσεις αυτές

34 Fluorescence detector
Fluorescence Activated Cell Sorting 488 nm laser FALS Sensor Fluorescence detector - + Charged Plates Single cells sorted into test tubes Purdue University Cytometry Laboratories

35 Ένας κυτταρομετρητης ροής αποτελείται από τα εξής μέρη
Αρχές λειτουργίας Ένας κυτταρομετρητης ροής αποτελείται από τα εξής μέρη Πηγή φωτός (ακτίνα LASER Argon-ion) Υδραυλικό σύστημα που αναγκάζει τα κύτταρα να ρέουν το ένα μετά το άλλο μπροστά στην ακτίνα LASER Ανιχνευτές του φωτός και του φθορισμού Μονάδα ηλεκτρονικού υπολογιστή για την επεξεργασία των σημάτων

36

37 Απο το σημείο εστίασης διέρχονται περίπου 500 κύτταρα το δευτερόλεπτο
Τα κύτταρα που μελετώνται δια του κυτταρομετρητού ροής ρέουν υπό την μορφή υγρού λεπτής ροής και δια του υδροηλεκτρικού εστιασμού οδηγούνται στο σημείο στο οποίο θα συναντηθούν με την ακτίνα LASER. Εντός της κάθε μιας σταγόνας που διέρχεται από το σημείο εστίασης βρίσκεται ένα και μονό κύτταρο. Απο το σημείο εστίασης διέρχονται περίπου 500 κύτταρα το δευτερόλεπτο

38 Flow Cell Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath
fluid Fluorescence signals Focused laser beam Purdue University Cytometry Laboratories

39 Προετοιμασία του δείγματος
Αφορά την μετατροπή του δείγματος σε εναιώρημα κυττάρων και την σύνδεση με τις φθορίζουσες χρωστικές. Όταν πρόκειται για περιφερικό αίμα ή μυελό των οστών, μετά την επώαση του δείγματος με τα συνδεδεμένα με φθοριοχρώματα (φλουορεσκείνη, φυκοερυθρίνη κ.α.) μονοκλωνικά αντισώματα ακολουθεί λύση των ερυθρών αιμοσφαιρίων με ποικιλία μεθόδων, οπότε προκύπτει εναιώρημα λευκών αιμοσφαιρίων

40 Οπτική αρχή της μέτρησης
Βασίζεται στο φαινόμενο της σκέδασης του φωτός όταν αυτό προσπίπτει σε μικρά σωματίδια. Κάθε κύτταρο δέχεται την ακτινοβολία κάθετα προς την ροή του. Ένα μέρος αυτής απορροφάται ενώ το υπόλοιπο σκεδάζεται προς όλες τις κατευθύνσεις στο χώρο και ανιχνεύεται υπό διαφορετικές γωνιές με διάταξη ειδικών φωτοδιόδων

41

42 Αν η ανίχνευση του σκεδαζόμενου φωτός γίνεται υπό γωνία 20 έως 280 έχουμε τη μέτρηση του κατ΄ευθείαν ή προσθίως σκεδαζόμενου φωτός (Forward Light Scatter, FSC) Αν η ανίχνευση γίνεται υπό γωνία 900 τότε έχουμε τη μέτρηση του καθέτως ή πλαγίως σκεδαζόμενου φωτός (Side Scatter SSC)

43 Forward Angle Light Scatter
FALS Sensor Laser Purdue University Cytometry Laboratories

44 90 Degree Light Scatter Laser FALS Sensor 90LS Sensor
Purdue University Cytometry Laboratories

45 Η μέτρηση με FSC είναι πολύ σημαντική, γιατί είναι αντίστοιχη του μεγέθους του κυττάρου και χρησιμοποιείται για να ξεχωρίσει διαφορετικά είδη κυττάρων, όπως λευκά και ερυθρά αιμοσφαίρια, αιμοπετάλια ή αλλά κύτταρα Η μέτρηση με τον ανιχνευτή SSC δίνει πληροφορίες για την κυτταροπλασματική κοκκίωση

46 Με βάση τις παραμέτρους σκέδασης του φωτός, FSC ή SSC, διαχωρίζονται οι τρεις κύριοι υποπληθυσμοί των λευκοκυττάρων (λεμφοκύτταρα, μονοκύτταρα, πολυμορφοπύρηνα). Οριοθετείται ο υπό εξέταση υποπληθυσμός -gated out- (συνήθως τα λεμφοκύτταρα) και στη συνέχεια μέσω του ηλεκτρονικού υπολογιστή όλα τα δεδομένα του φθορισμού αφορούν τον οριοθετημένο πληθυσμό.

47 Light Scatter Gating Side Scatter Projection Neutrophils Scale
1000 200 100 50 40 Monocytes 30 20 15 Lymphocytes 8 200 400 600 800 1000 90 Degree Scatter Purdue University Cytometry Laboratories

48

49 Εκτός από τη σκέδαση του φωτός στην κυτταρομετρία ροής μελετάται και αναλύεται ένα ακόμα φυσικό φαινόμενο που είναι ο φθορισμός. Φθορισμός είναι η ιδιότητα ορισμένων ουσιών να εκπέμπουν ακτινοβολία μεγαλύτερου μήκους κύματος από αυτήν που δέχονται (διεγείρουσα ακτινοβολία).

50 Εφόσον τα εξεταζόμενα κύτταρα τα επεξεργαστούμε με ανιχνευτές που φθορίζουν - μονοκλωνικά ή πολυκλωνικά αντισώματα, ενωμένα με φθορίζουσες χρωστικές που ανιχνεύουν χαρακτηριστικά αντιγόνα κυττάρων, καθώς και χημικές φθορίζουσες ουσίες που συνδέονται με το DNA και το RNA - εκτός από τη σκεδαζόμενη πρωτογενή ακτινοβολία, μπορεί να ανιχνευθεί και η δευτερογενής από τον φθορισμό ακτινοβολία (flurescence-1 FL-1 πράσινος φθορισμός, flurescence-2 FL-2 κόκκινος φθορισμός).

51

52 Η πλέον συνηθέστερη φθορίζουσα χρωστική ή φθοριόχρωμα είναι η φλουορεσκεΐνη στην ισοθειοκυανική της μορφή (FITC). Χρησιμοποιείται ευρέως γιατί η περιοχή διέγερσης της είναι στα 494nm και συμπίπτει με το μήκος κύματος απο το Laser Argon-ion (488 nm). Αλλά φθοριοχρώματα που χρησιμοποιούνται στην κυτταρομετρία ροής είναι η φυκοερυθρίνη και η φυκοκυανίνη.

53 Τα λεμφοκύτταρα διακρίνονται από τα υπόλοιπα κύτταρα του αίματος εξ΄αιτίας του μικρού μεγέθους (μικρή τιμή FSC), της μικρής εσωτερικής κοκκίωσης (μικρή τιμή SSC), καθώς και της μεγάλης συγκέντρωσης μορίων CD45 στην επιφάνεια τους, σε σύγκριση με τα μονοκύτταρα και τα κύτταρα της κοκκιώδους σειράς Τα μονοκύτταρα αναγνωρίζονται από το μεγάλο μέγεθος που παρουσιάζουν και τη μεγάλη συγκέντρωση του μορίου CD14 στην επιφάνεια τους Τα κύτταρα της κοκκιώδους σειράς απαντώνται στο άνω κεντρικό τμήμα του κυτταρογράμματος λόγω της μεγάλης κοκκίωσης τους, ενώ παρουσιάζουν μέτρια συγκέντρωση του μορίου CD45 και μικρή συγκέντρωση του μορίου CD14

54

55 Τα δεδομένα μπορούν να παρασταθούν και με άλλους τρόπους
Ανάλυση δεδομένων Συνηθέστερος τύπος ανάλυσης δεδομένων είναι το σημειακό γράφημα κυτταροδιαγράμματος (dot plot) Για τον πληθυσμό που απομονώσαμε μπορούμε να πάρουμε ιστόγραμμα φθορισμού Τα δεδομένα μπορούν να παρασταθούν και με άλλους τρόπους Διάγραμμα κλειστής καμπύλης (contour plot) Ισομετρική απεικόνιση σε 3 άξονες (isometric plot) Απεικόνιση σε πολύεδρο (diamond view)

56

57 Κλινικές εφαρμογές της κυτταρομετρίας ροής
Φαινοτυπική ανάλυση λεμφοκυττάρων Διάγνωση ανοσοκατασταλτικών νοσημάτων Πρόγνωση των HIV θετικών ασθενών Έλεγχος της ανοσοθεραπείας ή της χημειοθεραπείας σε ανοσοκατασταλτικά νοσήματα Έλεγχος της κατανομής του ανοσολογικού συστήματος στα μεταμοσχευθέντα άτομα Φαινοτυπική ανάλυση κακοήθων κυττάρων Διάγνωση και τυποποίηση λευχαιμιών και λεμφωμάτων Διαφοροποίηση των αιμοποιητικών από μη αιμοποιητικά κακοήθη κύτταρα Πρόγνωση των κακοηθειών

58 (συνέχεια) DNA ανάλυση Αρίθμηση δικτυοκυττάρων Κυτταρογενετική
Μελέτη της φάσης του κύκλου των κυττάρων Αρίθμηση δικτυοκυττάρων Κυτταρογενετική Σταυροειδής έλεγχος σε υπομεταμόσχευση ασθενών

59 Ανοσοφαινότυπος υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων
Ανοσοφαινότυπος υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση ή ανοσοφαινότυπος (Immunophenotyping) με κυτταρομετρία ροής βασίζεται στην ταυτοποίηση ενός ή πολλών μεμβρανικών ή ενδοκυττάριων ή πυρηνικών αντιγόνων των κυττάρων σε εναιώρημα, ταυτόχρονα με τον σκεδασμό που δίνουν τα κύτταρα στο προσπίπτον σ΄αυτά φως. Με την κυτταρομετρία ροής επιτυγχάνεται η ανοσολογική ταυτοποίηση και ο χαρακτηρισμός του νεοπλασματικού κλώνου των κυττάρων στις διάφορες αιμοποιητικές σειρές

60 (συνέχεια) Κατά τον προσδιορισμό του ανοσοφαινότυπου των υποπληθυσμών λεμφοκυττάρων χρησιμοποιείται αρχικά ο συνδυασμός CD2 και CD20 για τον διαχωρισμό των Β, ΝΚ και Τ-λεμφοκυττάρων. Με βάση το εκατοστιαίο ποσοστό έκφρασης των CD20+ και CD2+ εκτιμάται το ποσοστό των Β και του αθροίσματος ΝΚ και Τ-κυττάρων αντίστοιχα Χρησιμοποιείται ο συνδυασμός CD3/CD4 με σκοπό τον προσδιορισμό των CD3+ κυττάρων που αποτελούν το σύνολο των Τ-λεμφοκυττάρων Επιπλέον, μετρείται ο CD3+ CD4+ Τ-λεμφοκυτταρικός πληθυσμός που αποτελεί τα βοηθητικά Τ-λεμφοκύτταρα

61 (συνέχεια) Κατά την ανάλυση με τον συνδυασμό CD3/CD8 μετρούνται τα Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα (CD3+ CD8+) και τέλος με τον συνδυασμό CD3/CD16/56 προσδιορίζονται τα ΝΚ (CD3- CD16/56+) και τα ΝΚ-like Τ-κύτταρα (CD3+ CD16/56+) Αν αθροίσουμε τα ποσοστά έκφρασης των κυττάρων αυτής της εξέτασης θα πρέπει να έχουν αποτέλεσμα που θα προσεγγίζει το 100% του ποσοστού των λεμφοκυττάρων

62 T CD2 CD3/CD4 TH CD3/CD8 TC B CD20 NK CD3 CD16/56

63 Τυποποίηση Οξείας Λευχαιμίας
Τυποποίηση Οξείας Λευχαιμίας Η κυτταρομετρία ροής αποτελεί μια αντικειμενική και αναπαραγώγιμη μέθοδο με την οποία επιτυγχάνεται Αναγνώριση του παθολογικού πληθυσμού και προσδιορισμός της κυτταρικής σειράς Ανάλυση της κλωνικότητας Ανάλυση της κυτταρικής ωριμότητας και της ετερογένειας του παθολογικού κυτταρικού πληθυσμού Ποσοτική μέτρηση της έκφρασης των αντιγόνων στα αιμοποιητικά κύτταρα Ταυτοποίηση σύνθετων αντιγονικών συνδυασμών που σχετίζονται με τη βιολογία της νόσου Εφαρμογή των ευρημάτων στην παρακολούθηση και στη θεραπεία, καθώς και στην αναζήτηση της υπολειπόμενης νόσου

64 (συνέχεια) Για τον προσδιορισμό της κυτταρικής σειράς των βλαστικών κυττάρων χρησιμοποιούνται Ειδικοί δείκτες κυτταρικής σειράς (ΜΡΟ, cyCD3) Δείκτες αωρότητας (CD34) Δείκτες που προσδιορίζουν τα διάφορα στάδια διαφοροποίησης (CD1)

65 (συνέχεια) Η τυποποίηση Οξείας Λευχαιμίας (AL) με κυτταρομετρία ροής, επιτυγχάνεται με τη χρήση τριπλού ή τετραπλού φθορισμού Στο διπλό ανοσοφθορισμό η επιλογή των κυττάρων βασίζεται στις παραμέτρους που σχετίζονται με την μορφολογία του κυττάρου (FSC, SSC) Στον τριπλό ή τετραπλό ανοσοφθορισμό χρησιμοποιείται ένας δείκτης, συνήθως σε συνδυασμό με SS, για ανοσολογικό gating των προς μελέτη κυττάρων (CD19 για B, cyCD3 για T-ALL, CD45 για AML) Ο αριθμός των κυττάρων που συλλέγονται για ανάλυση είναι ή ιδανικότερα

66 Τυποποίηση Οξείας Λεμφοβλαστικής Λευχαιμίας (ALL)
Εφαρμόζεται τριπλός φθορισμός με χρήση ειδικών μονοκλωνικών αντισωμάτων όλων των κυτταρικών σειρών που επηρεάζονται κατά την λευχαιμογένεση για την εύρεση της κυτταρικής σειράς από την οποία προέρχεται ο νεοπλασματικός πληθυσμός Με βάση την πλάγια σκέδαση παρατηρείται θετικότατη έκφραση στο CD45 (πανλευκοκυτταρικός δείκτης) Ασθενής ένταση στο CD45 αποτελεί αποκλειστικό χαρακτηριστικό των βλαστικών κυττάρων σε αντίθεση με τα λεμφοκύτταρα που έχουν υψηλές τιμές έντασης φθορισμού του CD45

67 (συνέχεια) Παρατηρείται αυξημένο ποσοστό συνέκφρασης των CD10/CD19 (δείκτες των Β-λεμφοκυττάρων) και του CD34, καθώς και μηδενική έκφραση δεικτών μυελικής και Τ-λεμφοκυτταρικής σειράς (παθολογικός κυτταρικός πληθυσμός της Β-λεμφοκυτταρικής σειράς)

68 Τυποποίηση Οξείας Μυελοβλαστικής Λευχαιμίας (AML)
Εφαρμόζεται τετραπλός φθορισμός Παρατηρείται παθολογικός πληθυσμός από το μεγάλο του ποσοστό αλλά και από τα χαρακτηριστικά του (weak CD45) Η οριοθέτηση αυτή αποκαλείται ΄΄βλαστικό παράθυρο΄΄ Το CD34 εκφράζεται σε πολύ μεγάλο ποσοστό και επιβεβαιώνει την παρουσία βλαστικών κυττάρων Επισημαίνεται ότι οι δείκτες CD33 και CD13 αποτελούν δείκτες διαφόρων σταδίων ωρίμανσης της μυελικής σειράς

69 Panels ALL CD45 CD10/ CD19 CD13 CD33 AML CD34 CD117 HLADR/ CD13

70 Ανοσοανεπάρκειες Ο κύριος παθογενετικός μηχανισμός στη λοίμωξη HIV είναι η ελάττωση των CD4+ Τ-κυττάρων Πρώιμη όμως εκδήλωση είναι η αύξηση του πληθυσμού των CD8+ Τ-κυττάρων Η ελάττωση των CD4+ κυττάρων στο περιφερικό αίμα αποτελεί προγνωστικό δείκτη για την εξέλιξη του AIDS, και χρησιμεύει στη λήψη αποφάσεων που αφορούν την έναρξη και την παρακολούθηση θεραπείας Η βαρύτητα της ελάττωσης μπορεί να μετρηθεί με τον προσδιορισμό της εκατοστιαίας αναλογίας των CD3+ CD4+, με τον απόλυτο αριθμό των CD3+ CD4+ ή με τον λόγο CD3+ CD4+ / CD3+ CD8+ Ο υποπληθυσμός CD8+ CD28+ παραμένει αυξημένος σε HIV οροθετικά άτομα με μακρά επιβίωση, ενώ ελαττώνεται κατά την εξέλιξη σε AIDS

71 Αυτοάνοσα νοσήματα Η οξεία φάση των αυτοάνοσων νοσημάτων χαρακτηρίζεται κατά κανόνα απο αύξηση της αναλογίας των CD4+ / CD Τ-λεμφοκυττάρων Η διαταραχή των Τ-λεμφοκυττάρων παρέρχεται μετά τη χορήγηση κατάλληλης ανοσοκατασταλτικής θεραπείας Η μείωση των CD8+ Τ-λεμφοκυττάρων σχετίζεται με την κλινική βαρύτητα της νόσου Ο CD19+ και ο CD5+ υποπληθυσμός των Β-λεμφοκυττάρων θεωρείται υπεύθυνος για την παραγωγή των αυτοαντισωμάτων

72 Λοιμώδη νοσήματα Η ανοσοφαινοτυπική ανάλυση συμβάλει στη διαφορική διάγνωση της ιογενούς απο τη βακτηριδιακή λοίμωξη Η οξεία φάση μιας ιογενούς λοίμωξης συνοδεύεται απο μείωση της αναλογίας των CD4+ / CD Τ-λεμφοκυττάρων λόγω αύξησης των CD8+ κυττάρων Η οξεία βακτηριδιακή λοίμωξη χαρακτηρίζεται απο μείωση των ολικών Τ-λεμφοκυττάρων CD4+ και CD8+ Οι ανοσοφαινοτυπικές διαταραχές παρέρχονται κατά την υποχώρηση της λοίμωξης

73 Έλεγχος αντοχής στα αντιβιοτικά
Έλεγχος αντοχής στα αντιβιοτικά Η ανίχνευση της αντοχής στα αντιβιοτικά βασίζεται στις αλλαγές της κυτταρικής μεμβράνης τις οποίες αυτά προκαλούν στα κύτταρα

74 Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας
Σας ευχαριστώ για την προσοχή σας