实验四 质粒的电泳检测和酶切.

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1 实验四 质粒的电泳检测和酶切

2 质粒检测： 电泳检测：质粒电泳一般有三条带，分别为质粒的超螺旋、开环、线型三种构型。 吸光值检测：采用分光光度计检测260nm、280nm波长吸光值，若吸光值260nm/280nm的比值介于1.7－1.9之间，说明质粒质量较好，1.8为最佳，低于1.8说明有蛋白质污染，大于1.8说明有RNA污染。

3 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳是利用琼脂糖熔化后再凝固后能形成带有一定空隙的固体基质的特性，其孔隙的大小取决于琼脂糖的浓度。在电场的作用及中性PH缓冲条件下，带负电的核酸分子就可以向阳极移动。

4 胶浓度（％） 线性DNA分子大小（kb） 0.3 5～60 0.6 1～20 0.7 0.8～10 0.9 0.5～7 1.2 0.4～6 1.5 0.2～4 2.0 0.1～3 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。

5 限制性内切酶的相关基础知识 核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等动物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚合酶、连接酶及末端修饰酶等一起被称为工具酶。限制性内切酶是DNA重组的重要工具。

6 限制性核酸内切酶的类型及特性 按限制性酶的组成、与修饰酶活性关系以及切断核酸的情况不同，分为三类：Ⅰ类、Ⅱ类和Ⅲ类。
II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。 这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。这种酶的切割可以有两种方式：

7 质粒的酶切 每种酶有特异的识别核酸序列，称为酶切位点，一般为回文序列。 所有的限制性内切酶切割DNA均产生含5′磷 酸基和3′羟基基团的末端 。

8 酶切反应中应注意以下几个问题： ．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端；
内切酶的用量 根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通 常 1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ 底物所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对 ２－３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 使用时防止操作中对内切酶的污染。

9 ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中 不能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等， 这些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过： 增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。

10 反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中 Mg2+为内切酶辅基；
Tris·HCl维持反应体系pH值在 之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度： 低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。

11 酶解温度与时间： 大多数限制酶反应温度为３７℃，如EcoRⅠ, HindⅢ, BamHⅠ, PstⅠ等，也有如BclⅠ需在５０℃下进行反应，3小时即可充分酶解。

12 实验方法： 按下表分别加入各试剂（注意限制性内切酶最后加入且在冰上操作）于Eppendorf管中。 无菌水 12μl DNA 5μl
10×buffer 2μl 内切酶 μl 总体积： μl