DNA 的提取方法简介 为了研究 DNA 分子在生命代谢中的作用，常常 需要从不同的生物材料中提取 DNA. 由于 DNA 分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适 当的材料提取 DNA 。 动植物中，小牛胸腺 ۰ 动物肝脏 ۰ 鱼类精子，植 物种子的胚中都含有丰富的 DNA 。 微生物中，谷氨酸菌体含.

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1 DNA 的提取方法简介 为了研究 DNA 分子在生命代谢中的作用，常常 需要从不同的生物材料中提取 DNA. 由于 DNA 分子在生物体内的分布及含量不同，要选择适 当的材料提取 DNA 。 动植物中，小牛胸腺 ۰ 动物肝脏 ۰ 鱼类精子，植 物种子的胚中都含有丰富的 DNA 。 微生物中，谷氨酸菌体含 7%~10% ，面包酵母 含 4% ，啤酒酵母含 6% ，大肠肝菌含 9%~10% 。

2 从各种材料中提取 DNA 方法不同，分离提取的 难易程度也不同。 对于低等生物。如从病毒中提取 DNA 比较容 易，多数病毒 DNA 分子量较小，提取时易保 持其结构完整性。 从细菌及高等动植物中提取 DNA 难度大一些。 细菌 DNA 分子量较大，一般达 2×10 道尔顿。 因此易被机械张力剪断。细菌 DNA ，除核 DNA 外，还有质粒 DNA 等。

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5 1 、核酸的理化性质 RNA 和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶， DNA 则 为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有 鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA 、 RNA 和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于 水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离 酸易溶于水， RNA 钠盐在水中溶解度可达 40g/L 。 DNA 在水中为 10g/L ，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中， DNA 、 RNA 易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。

6 天然状态的 DNA 是以脱氧核糖核蛋白 (DNP) 形式存 在于细胞核中。要从细胞中提取 DNA 时，先把 DNP 抽提出来，再把 P 除去，再除去细胞中的糖， RNA 及无机离子等，从中分离 DNA 。 DNP 和 RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响而 不同。 DNP 在低浓度盐溶液中，几乎不溶解，如在 0.14 mol/L 的氯化钠溶解度最低，仅为在水中溶解度 的 1% ，随着盐浓度的增加溶解度也增加，至 1mol/L 氯化钠中的溶解度很大，比纯水高 2 倍。 RNP 在盐溶液中的溶解度受盐浓度的影响较小，在 0.14mol/L 氯化钠中溶解度较大。因此，在提取时， 常用此法分离这两种核蛋白。

7 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方 法有三种： ①机械方法：超声波处理法、研磨法、 匀浆法； ②化学试剂法：用 SDS 处理细胞； ③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可 使细胞壁破碎。 2. 细胞的破碎

8 由于高等动物 DNA 主要存在于细胞核与线粒体中， 所以提取时有两个困难（高等植物与此类似）： ①破碎细胞难；从处死动物 ٠ 分离组织器宫到 破碎细胞费时长。在此时期间 DNA 可能会被 DN ase 降解，而动物组织：特别是肌肉组织很难破碎, 即使是较易破碎的肝 ٠ 肾等组织也往往使用组织 匀浆器，易造成 DNA 断裂。 ②分子量大，一般比细菌的大 2—3 个数量级， 比病毒的大 4—5 个数量。对不同生物材料，要根 据具体情况选择适当的分离提取方法。

9 3.DNA 提取的几种方法 (1). 浓盐法 利用 RNP 和 DNP 在电解溶液中溶解度不同，将二者分离，常 用的方法是用 1M 氯 纳提取化钠抽提, 得到的 DNP 粘液与含有少 量辛醇的 氯仿一起摇荡, 使乳化, 再离心除去蛋白质, 此时蛋白质 凝胶停留在水相及氯仿相中间，而 DNA 位于上层水相中, 用 2 倍 体积 95% 乙醇可将 DNA 钠盐沉淀出来. 也可用 0.15 MNaCL 液反复洗涤细胞破碎液除去 RNP, 再以 1MNaCL 提取脱氧核糖蛋白, 再按氯仿 --- 异醇法除去蛋白. 两种方法比较, 后种方法使核酸降解可能少一些. 以稀盐酸溶液提取 DNA 时, 加入适量去污剂, 如 SDS 可有助于 蛋白质与 DNA 的分离。在提取过程中为抑制组织中的 DNase 对 DNA 的降解作用, 在氯化钠溶液中加入柠檬酸钠作为金属离子 的烙合剂. 通常用.15MNaCL,0.015M 柠檬钠, 并称 SSC 溶液, 提取 DNA.

10 （ 2 ）. 阴离子去污剂法 : 用 SDS 或二甲苯酸钠等去污剂使蛋白质变性, 可以直 接从生物材料中提取 DNA. 由于细胞中 DNA 与蛋白质之 间常借静电引力或配位键结合, 因为阴离子去污剂能够 破坏这种价键, 所以常用阴离子去污剂提取 DNA. （ 3 ）. 苯酚抽提法 : 苯酚作为蛋白变性剂, 同时抑制了 DNase 的降解作用. 用苯酚处理匀浆液时, 由于蛋白与 DNA 联结键已断, 蛋白 分子表面又含有很多极性基团与苯酚相似相溶。蛋白分 子溶于酚相，而 DNA 溶于水相。离心分层后取出水层， 多次重复操作，再合并含 DNA 的水相，利用核酸不溶 于醇的性质，用乙醇沉淀 DNA 。此时 DNA 是十分粘稠 的物质，可用玻璃漫漫绕成一团，取出。此法的特点是 使提取的 DNA 保持天然状态.

11 （ 4 ）. 水抽提法 : 利用核酸溶解于水的性质, 将组织细胞破碎后, 用低 盐溶液除去 RNA ，然后将沉淀溶于水中，使 DNA 充 分溶解于水中, 离心后收集上清液. 在上清中加入固体 氯化钠调节至 2.6M. 加入 2 倍体积 95% 乙醇, 立即用搅拌 法搅出. 然后分别用 66% ٠ 80% 和 95% 乙醇以及丙铜洗 涤, 最后在空气中干燥, 既得 DNA 样品. 此法提取的 DNA 中蛋白质含量较高, 故一般不用. 为除蛋白可将此法加 以改良, 在提取过程中加入 SDS.

12 二. 从猪脾中提取 DNA

13 1. 操作步骤 : 取鲜猪脾, 去脂、血, 称取 10g, 用预冷的 1×SSC 溶液洗 2 次，剪碎。 按睥： 1×SSC=1; 5W/V 加入 50ml 预冷的 1×SSC ，用高速组织 捣碎机破碎 8 次, 每次 5 秒, 中间间隔 30 秒。 将匀浆液放在烧杯中， 于冰盐浴中冷却 30 分钟。 4000 转 / 分钟 离心 10 分钟。充掉上清。沉淀物中再加 2 倍体积的 1×SSC 搅匀，离心， 弃上清，重复 2 次。 将所得沉淀悬于 5 倍体积的 PH8.0 、 0.15MNaCL—0.1Na 2 MEDTA 溶液中。边搅拌边漫漫滴加 5%SDS 最终浓度达 1% 为止。然后加入 固体氯化钠使其最终浓度达 1mol/L ，继续搅 60 分钟，以确保氯化钠 全溶。所得混合液倒入磨口塞的锥形瓶中，加入同体积氯仿 — 异戊 醇，激烈振荡 20 分钟， 4000r 离心 20 分钟，上层水相取出后倒入烧杯， 以同积氯仿 — 异戊醇重复去蛋白 2 次。 取出水相于烧杯中，逐渐加入 2 倍体积 95% 乙醇，玻棒搅动， DNA 纤维绕于璃玻棒上后挤干，用 70% 乙醇洗 DNA 纤维 2 次，用 95% 乙醇洗一次，再用乙醚洗一次，取出并挤干 。

14 2. 实验材料，仪器和试剂： （ 1 ） 实验材料：新鲜猪脾： （ 2 ）仪器：量筒： 1×10 、 3×100 烧杯： 2×100 ， 2×250 ；磨 口锥形瓶： 1×250 、 1×500 ；吸管： 1×1 、 1×10 ；滴管、玻棒、 离心机、电动搅拌器、台秤、剪刀、镊子。 （ 3 ） 试剂： ① 20×SSC ： 175.2gNaCL ， 88.2g 柠檬酸钠 2H 2 O ， PH=7.0 加 水至 1000ml ； ② 1×SSC ， 0.1×SSC 由①做相应的稀释得来； ③ NaCL-Na 2 EDTA 液： 8.77gNaCL ， 3.72gNa 2 EDTA 溶于 800ml 蒸馏水中，用固体 NaOH 调 PH=8 后定容至 1000 ； ④ 5%SDS （ W/V ）： 6gSDS 溶于 100ml45% 乙醇中； ⑤ 氯仿 - 异戊醇 =24 ： 1 （体积比） ⑥ 其他 :95% 乙醇，盐冰. 数据 :DNA 重, 产率 : 待测液中测得的核酸 μg 数 DNA%= ×100 待测液中制品的 μg 数

15 二苯胺显色法测定 DNA 含量 强酸、加热条件下，可以使 DNA 中的嘌呤碱基与 脱氧核糖间的糖苷键断裂，而产生嘌呤碱基，脱氧 核糖与嘧啶核苷酸。其中 2 ˊ脱氧核糖在酸性环境中成 为 ω― 羟基 ―γ― 酮基戊醛，此物与二苯胺反应生成 蓝色化合物，在 595nm 处有最大吸收。 DNA 在 40- 400μg 范围内光密度与 DNA 浓度成正比。在反应液中 加入少量乙醛可提高灵敏度，而且其他化合物的干 扰也显著降低。当样品含少量 RNA 时不影响测定， 而蛋白质、多种糖及其衍生物芳香，羟基醛都能与 二苯胺形成各种有色物质，干扰测定。

16 １、二苯胺试剂：使用前称取 0.8g 二苯胺（需在 70% 乙醇试 剂中重结晶 2 次 ) ，溶于 180ml 冰乙酸中，再加入 8ml 过氯酸 （ 60% 以上），混匀待用，临用前加入 0.8ml 1.6% 乙醛溶液，所 配试剂应为无色。 每组需 56ml 共需 2800ml ２、 DNA 标准溶液：（须经定磷法确定其浓度）取标准 DNA 以 0.01N NAOH 配成 200 微克／毫升的标准液。 每组需 12ml 共需 600ml ３、 1.6% 乙醛：取 47% 乙醛 3.4ml ，加重蒸水定容至 100ml （放于冰箱中，一周之内可以使用）。 共需 70ml ４、 ( 测样品液：准确称取猪脾 DNA 或用紫外分光法中剩下 的 DNA 液配成 10 微克／毫升的溶液。 每组需 4ml 共需 200ml

17 操作方法： 1. DNA 标准曲线的制定： 取 10 支试管，分成 2 组，依次加入 0.4 、 0.8 、 1.2 、 1.6 和 2.0mlDNA 标准溶液。添加蒸馏水，使之都成为 2ml 。另 取 2 只试管，各加 2ml 蒸馏水作为对照。然后各加入 4ml 二 苯胺试剂，混匀。于 60 恒温水浴中保温 1h ，冷却后于 595nm 处进行比色测定。取两管平均值，以 DNA 浓度为横 坐标，光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。 2. 制品的测定： 取 2 支试管，各加 2ml 待测液（内含 DNA 应在标准曲 线的可范围之内）和 4ml 二苯胺试剂，摇匀。其于操作同 标准曲线的制作。 3. 根据测得的光吸收值，从标准曲线待测上查出相应 该光吸收值 DNA 的含量，计算出制品中的百分含量。

18 1. 为什么在低温下进行？ 2. 分别加柠檬酸钠和 EDTA 的作用 ? 3. 加 SDS 的作用？ 4. 加 NaCL 的作用，为什么要加到 1mol/L? 5. 加入异戊醇有什么作用？