指导老师：郭祥群作者：吴晓斌NO.03081021. 层析法是目前广泛应用的一种分离技术。是利用不 同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 按照不同的标准层析法有不的分类。根据层析峰的 位置及峰高或峰面积, 可以定性及定量。层析法与光 学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组 份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子.

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1 指导老师：郭祥群作者：吴晓斌NO.03081021

2 层析法是目前广泛应用的一种分离技术。是利用不 同物质理化性质的差异而建立起来的技术。 按照不同的标准层析法有不的分类。根据层析峰的 位置及峰高或峰面积, 可以定性及定量。层析法与光 学、电学或电化学仪器连用，可检测出层析后各组 份的浓度或质量，同时绘出层析图。层析仪与电子 计算机联用，可使操作及数据处理自动化，大大缩 短分析时间。由于层析法具有分辨率高、灵敏度高、 选择性好、速度快等特点，因此适用于杂质多、含 量少的复杂样品分析，尤其适用于生物样品的分离 分析。近年来，已成为生物化学及分子生物学常用 的分析方法。在医药卫生、环境化学、高分子材料、 石油化工等方面也得到了广泛的应用。 在层析法实验技术有凝胶层析法、离子交换层析法、 高效液相层析法、亲和层析法、聚焦层析法；

3 （一）聚焦层析法 聚焦层析是一种操作简单、廉价的层析技术。它的 原理是根据各种蛋白质的等电点不同进行分离的过 程，因此本方法具有高分辨、高度浓缩和高度专一 等特点。 聚焦层析所用的凝胶首先用高 pH 溶液平衡，然后 用多元缓冲液进行洗脱，多元缓冲液 pH 呈梯度下 降。 聚焦层析所用凝胶主要有两种： MONOP 和多元缓 冲液交换剂（ PBE ）。其中 MONOP 是带孔小珠， 孔中被带正电荷的胺基填充，适用于高效聚焦层析。 多元缓冲液交换剂是一种交换凝胶，适用作普通聚 焦层析的介质。各种凝胶性质见表。各种凝胶性质见表。

4 表 聚焦层析技术数据凝胶名称 pH 范围 洗脱MONOP11-8 Pharmalyte 8- 10.5 PBE11-8 MONOP9-6 多元缓冲液 96 PBE 94 7-4 多元缓冲液 74 PBE947-4

5 NONOP 可制成两种高效液相柱： MONOP HR5/5(1ml) ，和 MONOP HR5/20(5ml) 。使用时根据样 品复杂性选择相应的柱。 HR5/5 分辨率为 pI>0.2 ， HR5/20 pI>0.02 。 多元缓冲液交换剂 PBE ，属珠状交换剂凝胶，有 PBE 118 （ pH11-8 ）和 PBE （ pH9-4 ）。在聚焦层析时，通 过使用不同的洗脱液，可使交换容量发生改变，并且使 pH 达到更广的范围。

6 （二）离子交换层析法 离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动 相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 ⒈离子交换剂预处理和装柱 ⒈离子交换剂预处理和装柱 对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀 的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则 不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处 理，使之成为带 H+ 或 OH- 的交换剂型。阴离子交换剂常用 “ 碱 - 酸 - 碱 ” 处理，使最终转为 -OH- 型或盐型交换剂；对于阳 离子交换剂则用 “ 酸 - 碱 - 酸 ” 处理，使最终转为 -H- 型交换剂。 洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH 和离子强度。 已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒 大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱， 同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱 子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使 用。

7 ⒉加样与洗脱 加样 ： 层析所用的样品应与起 始缓冲液有相同的 pH 和离子强 度，所选定的 pH 值应落在交换 剂与被结合物有相反电荷的范 围，同时要注意离子强度应低， 可用透析、凝胶过滤或稀释法 达此目的。样品中的不溶物应 在透析后或凝胶过滤前，以离 心法除去。为了达到满意的分 离效果，上样量要适当，不要 超过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算，通 常上样量为交换剂交换总量的 1 ％ -5 ％。 加样 ： 层析所用的样品应与起 始缓冲液有相同的 pH 和离子强 度，所选定的 pH 值应落在交换 剂与被结合物有相反电荷的范 围，同时要注意离子强度应低， 可用透析、凝胶过滤或稀释法 达此目的。样品中的不溶物应 在透析后或凝胶过滤前，以离 心法除去。为了达到满意的分 离效果，上样量要适当，不要 超过柱的负荷能力。柱的负荷 能力可用交换容量来推算，通 常上样量为交换剂交换总量的 1 ％ -5 ％。 洗脱 ：已结合样品的离子交换前，可 通过改变溶液的 pH 或改变离子强度的 方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH 与离子强度。为了使复杂的组份分离完 全，往往需要逐步改变 pH 或离子强度， 其中最简单的方法是阶段 洗脱法 ，即 分次将不同 pH 与离子强度的溶液加入， 使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH 与离子强度的变化大，使许多洗脱 体积相近的成分同时洗脱，纯度较差， 不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是 连续梯度洗脱 。 洗脱时应满足 以下要求：①洗脱液体积应足够大，一 般要几十倍于床体积，从而使分离的各 峰不致于太拥挤。②梯度的上限要足够 高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 ③梯度不要上升太快，要恰好使移动的 区带在快到柱末端时达到解吸状态。目 的物的过早解吸，会引起区带扩散；而 目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

8 ( 三 ) 亲和层析法 ( 三 ) 亲和层析法 亲 和层析是利用待分离物质和它的特异性配体间具有特异的亲和力， 从而达到分离目的的一类特殊层析技术。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、 DNA 与互补 DNA 或 RNA 、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素（或药物）与它们的受体、维 生素和它的特异结合蛋白、糖蛋白与它相应的植物凝集素等。可亲和的一对 分子中的一方以共价键形式与不溶性载体相连作为固定相吸附剂，当含有混 合组份的样品通过此固定相时，只有和固定相分子有特异亲和力的物质，才 能被固定相吸附结合，其它没有亲和力的无关组份就随流动相流出，然后改 变流动组成份，将结合的亲和物洗脱下来。亲和层析中所用的载体称为基质， 与基质共价连接的化合物称配基。 亲和层析纯化过程简单、迅速，且分离效率高。对分离含量极少又不稳定的 活性物质尤为有效。但本法必须针对某一分离对象，制备专一的配基和寻求 层析的稳定条件，因此亲和层析的应用范围受到了一定的限制。 亲和层析可用于纯化生物大分子：稀溶液的浓缩；不稳定蛋白质的贮藏； 从纯化的分子中除去残余的污染物；用免疫吸附剂吸附纯化对此尚无互补配 体的生物大分子；分离核酸是亲和层析应用的一个重要方面。

9 应用实例： 2- 胰凝乳蛋白酶的提纯 ⒈亲和吸附剂（ Σ- 氨基 -N- 乙酰 - Ｄ - 色氨酸）的制备 取一定体 积的 Sepharose4B 加 100mgCNBr 。搅拌混合物，滴加 2- 8mol/L NaOH ，使溶液 pH 维持在 11.0 。 20 ℃左右， 8-12 分钟 完成反应。在布氏漏斗中抽滤活化的琼脂糖，然后用 20 倍体 积冷的 0.1mol/L NaHCO3 （ pH9.0 ）溶液洗涤。将上述活化 的 Sepharose4B 与等体积 0.1mol/L NaHCO3 （ pH9.0 并在冰 箱中预冷）溶液混合，接着迅速加入 α- 胰蛋白酶抑制剂（ Σ- 氨基 -N- 乙酰 - 色氨酸甲酯）。抑制剂的最大用量为每毫升 Sepharose 4B 65μmol/L 。 4 ℃缓慢搅拌约 24 小时，而后再用 水和缓冲液反复地洗至没有游离的抑制剂为止。制得的亲和 吸附剂在 50mmol/L Tris-HCl 缓冲液（ pH8.0 ）中保存备用。 ⒉分离 亲和吸附剂装柱后用 50mmol/L Tris-HCl （ pH8.0 ）缓 冲液平衡（室温）。样品溶于同样缓冲液中并上柱，再应用 同样缓冲液淋洗柱子。流速为 30-60ml/ 小时，直至 280nm 无 光吸收时停止洗涤，然后改用 0.2mol/L 醋酸缓冲液（ pH3.0 ） 洗脱。

10 【参考文献】 【参考文献】 1. 王昌华. 曹维笑. 化学通报， 1996 1. 王昌华. 曹维笑. 化学通报， 1996 2.Derossi D, Kajiwara K, Osada Y, et al.Polymer Gels. New York:Plenum,1991 2.Derossi D, Kajiwara K, Osada Y, et al.Polymer Gels. New York:Plenum,1991 3.Osada Y,Gong J P.Prog Polym Sci,1993 3.Osada Y,Gong J P.Prog Polym Sci,1993 4. 高等学校化学学报， 1994 4. 高等学校化学学报， 1994 新年快乐！！ ~~~~