生物化学实验之五 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定 食品与生物工程学院 王章存.

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1 生物化学实验之五 枯草芽孢杆菌蛋白酶活力的测定 食品与生物工程学院 王章存

2 一、实验目的 1. 加深了解酶活力的概念。 2. 学习和掌握测定蛋白酶活力的方法。 要重点掌握测定酶活的程序： 将酶液稀释到一定程度；
最适条件下进行酶促水解反应； 测定反应量； 根据酶活单位定义计算酶活力。

3 二、实验原理 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。
酶活力指酶催化某一特定反应的能力。其大小可用在一定条件下酶催化反应进行一定时间后，反应体系中底物的减少量或产物的生成量来表示。 酶活力单位是表示酶活力大小的重要指标。本实验规定酶活力单位(U)为一定条件下每分钟分解1μg 酪氨酸所需的酶量。 实验选用枯草杆菌蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸的反应体系。产物酪氨酸在碱性条件下与Folin-酚试剂反应生成蓝色化合物，该蓝色化合物在680nm 处有最大光吸收，其吸光值与酪氨酸含量呈正比。 因此通过测定一定条件下产物酪氨酸的含量变化，可计算出蛋白酶的活力。

4 三、实验仪器和试剂 仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
仪器: 恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。 枯草杆菌蛋白酶：称取1g 枯草杆菌蛋白酶粉，用少量0.02mol/L，pH7.5磷酸缓冲液溶解并定容至100mL，震荡15分钟，使充分溶解，干纱布过滤，取滤液冰箱备用。使用时视酶活力高低用缓冲液适当稀释。 试剂 mol/L 盐酸溶液 mol/L 氢氧化钠溶液 mol/L 碳酸钠溶液 %三氯乙酸溶液 5. 标准酪氨酸溶液(50μg/mL)：称取12.5mg 以烘干至恒重的酪氨酸，用0.2mol/L 盐酸约30mL 溶解后，蒸馏水定容至250mL。 6. 酪蛋白溶液(0.5%)：称取1.25g 酪蛋白，用0.04mol/L 氢氧化钠溶液(20mL)溶解，再用0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液定容到250mL。

5 7. 02mol/LpH7. 5磷酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4. 12H2O)7
mol/LpH7.5磷酸缓冲液： 称取磷酸氢二钠(Na2HPO4 . 12H2O)7.16g，用水定容至100mL(A 液)；称取磷酸二氢钠(Na2HPO4 .12H2O)3.12g，用水定容至100mL(B 液)。取A 液84mL，B 液16mL 混合后，得到0.2mol/LpH7.5磷酸缓冲液，可长期存放。临用时稀释10倍即可。 8. Folin-酚试剂： 在2L 磨口回流瓶中加入钨酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)100g，钼酸钠(Na2WoO4 . 2H2O)25g，蒸馏水700mL，85%磷酸50mL 以及浓盐酸100mL，充分混匀后，微火回流加热10小时。再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL 和液溴数滴，摇匀后开口继续煮沸15min，以驱赶过剩的溴。冷却后加蒸馏水定容至1000mL，过滤，溶液呈黄绿色，置于棕色试剂瓶中暗处贮藏。使用前用标准NaOH 溶液、酚酞为指示剂标定酸度(约为2mol/L)，然后加水稀释至1mol/L，即可使用。

6 四、操作步骤 (一) 酪氨酸标准曲线的制作 取6支试管(标号0，1~5)，按顺序分别加入0.00，0.20，0.40，0.60，0.80和1.00mL 标准酪氨酸溶液，再用水补足到1.00mL，摇匀后各加入0.55mol/L 碳酸钠5.0mL，摇匀。依次加入Folin—酚试剂1.00mL，摇匀并计时，于30℃水浴锅中保温15min。然后680nm 处测定吸光值(以0号管作对照)。以酪氨酸含量(μg)作横坐标，吸光值为纵坐标绘制标准曲线。

7 (二) 酶活力测定 1.酶反应： 取一支试管，加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，于30℃水浴中预热5分钟，再加入1.0mL已预热好的枯草杆菌蛋白酶液，立即计时，水浴中准确保温10min，从水浴中取出后，立即加入2.0mL的10%三氯醋酸溶液，摇匀静置数分钟，干滤纸过滤，收集滤液(样品液)。 另取一试管，先加入1.0mL 已预热好的枯草杆菌蛋白酶液和2.0mL 的10%三氯醋酸溶液，摇匀，放置数分钟，再加入2.0mL0.5%的酪蛋白溶液，然后于30℃水浴保温10min，同样干滤纸过滤，收集滤液(对照液)。 以上两过程，应各做一次平行实验。

8 2. 滤液中酪氨酸含量的测定 取3支试管，分别加入1. 0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5. 0 mL 0
2.滤液中酪氨酸含量的测定 取3支试管，分别加入1.0mL 水、A 液、B 液，然后各加入5.0 mL 0.55mol/L 碳酸钠溶液和1.00mLFolin-酚试剂，摇匀按标准曲线制作方法保温并测吸光度值。根据吸光度值，由标准曲线查出A、B 液中酪氨酸含量差值，即可推算出酶的活力单位。

9 实验过程示意图 酪蛋白 酪氨酸 磷钼蓝 磷钨蓝 比色测定 计算酶活力 调pH值、温度，加入蛋白酶，反应一定时间 加入Folin-酚试剂显色
680nm比色 比色测定 计算酶活力

10 五、结果处理 1.酶活单位定义： 在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。 2.计算 其中：
A 样品—样品液的吸光度值 A 对照—对照液的吸光度值 K—标准曲线上A=1时对应的酪氨酸μg 数 V—酶促反应液的体积(本实验为5mL) T—酶促反应时间(本实验为10min) N—酶溶液稀释倍数

11 六、注意事项 1.实验中所用试管必须干净、干燥； 2.各种试剂的取用量要准确，用吸量管量取； 3.过滤时用干滤纸
4.Folin-酚试剂的显色条件为碱性。

12 七、思考题 1、实验中加入碳酸钠的目的是什么？ 2、蛋白质与Folin-酚试剂也可显色，实验中如何排除为水解蛋白对测定结果的干扰？
3. 实验中哪些因素可能引起误差，如何操作避免这些误差。