Rubisco 和 Rubisco 活化酶 的生物学特性及其分离、纯化 研 究 生 : 陈 相 辉 导 师 : 王忠教授 专 业 : 植 物 学.

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2 Rubisco 和 Rubisco 活化酶 的生物学特性及其分离、纯化 研 究 生 : 陈 相 辉 导 师 : 王忠教授 专 业 : 植 物 学

3 Rubisco （ 1,5- 二磷酸核酮糖羧化酶／加氧酶 ）是光合 碳代谢中的关键酶，处于光合碳还原和光合碳氧化这两个 方向相反但又相互连锁的循环的交叉点上，调节着光合作 用和光呼吸的代谢比例，其活性大小对光合速率起着决定 性作用 。 一般认为，在阳光下，有充足水分和肥料的田间， 植物的光合生产力受其 CO 2 固定反应所限制（李立人， 1989 ）。因此若能增加空气中 CO 2 的浓度，则可使光合速 率上升；若能降低空气中 O 2 的浓度，抑制其加氧酶的反应， 也可使植物的光合速率增加。然而大气中 CO 2 和 O 2 的浓度 是一定的，分别为 0.03% 和 21% ，因此如何提高 Rubisco 酶 的活性或者提高羧化酶和加氧酶反应的相对比值，从而提 高植物的净光合速率，便成为人们研究的一个重要课题。

4 Rubisco 在叶片中含量很高，占可溶性蛋白的 50% 以 上，然而此酶的催化活性却很低，酶的活化成为植物光合作 用碳同化的限制因素。通常认为该酶受 CO 2 、 Mg 2+ 、光等因 素调节，但在酶活化机制的研究中仍然存在很多矛盾和无法 解释的问题。近年人们在多种植物叶绿体中发现一种调节 Rubisco 活性的酶, 称之为 Rubisco 活化酶 (Rubisco activase) 。 该酶是一种核编码的叶绿体蛋白, 其活性被 ATP 促进。 Rubisco 和 Rubisco 活化酶的特性一直是光合作用研究的热 点问题，目前，对 Rubisco 及其活化酶的研究已取得了重大进 展，不仅提纯了 Rubisco 及 Rubisco 活化酶，建立了活性测定 方法，而且鉴定了它们的氨基酸序列, 克隆了它们的 cDNA ，完 成了它们的基因表达, 人们还研究了各种磷酸糖与 Rubisco 活 化酶的相互作用，初步探讨了外界因素对两者的影响。

5 1. Rubisco 和 Rubisco 活化酶的 发现、结构及其活性调节

6 1.1 Rubisco 的发现、结构及其活性调节 1.1.1 Rubisco 的发现 1947 年， Wildman 和 Bonner 首先从菠菜叶片细胞中发 现了组分 1 蛋白，其后又发现组分 I 蛋白广泛存在于植物体 中，是绿色植物叶片中可溶性蛋白的主要组分。后来 Weissbach A 等在 1956 年证明了组分 I 蛋白就是催化光合作 用中 CO 2 固定的 RuBP 羧化酶， 1971 年 Orgren W L 等又发 现 RuBP 羧化酶是一个双功能酶，还能催化 RuBP 的氧化作 用。此后该酶就被称为核酮糖 -1 ， 5- 二磷酸羧化酶 / 加氧酶， 简称 Rubisco 。目前许多植物的 Rubisco 蛋白都已被结晶， 例如烟草的 Rubisco 晶体呈立方体状，油菜的 Rubisco 蛋白 除了呈立方体状外，还有呈棱台状的 。

7 1.1.2 Rubisco 的两种类型  类型 I Rubisco 由 8 个大亚基和 8 个小亚基组成，广泛存在 于所有真核和大多数原核的光合有机体中，大亚基一般由 475 个氨基酸残基组成，不同来源的 Rubisco 大亚基序列之 间有 80% 以上的同源性。大多数 Rubisco 小亚基由 123 个氨 基酸残基组成，不同植物间小亚基氨基酸序列的同源性比大 亚基低得多 [7] ，一般在 70% 左右，然而，小亚基序列中有两 个区域非常保守，即残基 10 ～ 21 和 61 ～ 67 ，暗示这些部分 可能有什么重要功能。  类型Ⅱ Rubisco 仅由 2 个大亚基构成，存在于一种紫色非 硫光合细菌深红红螺菌（ Rhodospirillum rubtnm ）。虽然 类型Ⅱ Rubisco 不含有小亚基，但它同样像类型 I Rubisco 一 样催化 RuBP 的羧化和氧化两个反应。

8 O 2 磷酸乙醇酸 光呼吸 RuBP PGA 光合 碳还原 CO 2 Rubisco 1.1.3 Rubisco 的作用机制

9 1.2 Rubisco 活化酶的发现、结构及其特性 1.2.1 Rubisco 活化酶的发现 Rubisco 体内外活化机制的矛盾，引起了人们对 Rubisco 活化机理研究的极大兴趣。 1982 年 Somerville 等 发现拟南芥（ Arabidopsis thaliana ）的突变株（ rca ）必 须生长在高浓度 CO 2 条件下，虽然它的 Rubisco 与野生型 的相同，但在光下却不能被激活。 Salvucci 等（ 1985 ） 进一步研究了 rca 与野生型之间叶绿体蛋白的差异，指出 突变株中丢失了 41 000 与 45 000 两个小肽。实验证明， 光下 Rubisco 的活化依赖于这两个肽段，现在人们把这两 个肽段合称为 Rubisco 活化酶（ Rubisco activase ）。迄 今，人们已利用免疫测定法（即 Rubisco 活化酶的抗体） 发现在许多高等植物、绿藻、蓝细菌都有 Rubisco 活化酶 的存在（ Salvucci 等， 1987 ）。

10 1.2.2 Rubisco 活化酶的分子特性 Rubisco 活化酶是一种核编码的叶绿体蛋白， 通常含有两种亚基（ 41 000 和 45 000 ）。但在不 同种中，亚基的种类与含量因植物种类的不同有 很大变化，如在烟草和玉米中仅含有一种亚基 41KD （唐如航等， 1997 ）；水稻、菠菜有 41KD 、 45KD 两条多肽（ To K Y ， 1999 ）。

11 1.2.3 Rubisco 活化酶的作用机制

12 1.2.4 Rubisco 活化酶和 ATP 在体外，活化酶对 Rubisco 的活化依赖于 ATP ，而被 ADP 抑制。 Robinson ， Portis （ 1998b ）和 Salvucci （ 1993 ） 指出纯化的活化酶对催化 ATP 水解具有较高活性，可以达 到 1.5μmolATP · mg -1 pro · min -1 。同时，水解反应要求 Mg 2+ 参 与，有一个较宽的 pH 范围，活性最高时， pH 为 8.0 ～ 8.5 。 测定 Rubisco 活化酶活性，发现缺乏 ATP 时， ATP 水解活性 和 Rubisco 活化活性均丧失。这表明 ATP 的水解是 Rubisco 活化酶的一个重要性质，是整个反应过程不可分割的部分。 Portis,1992 年报道了完整叶片内的活化酶活性同时受到 ATP 和 ADP 浓度的影响，即叶片内的 ATP/ADP 比值的变化 与 Rubisco 活性的变化密切相关。

13 2. Rubisco 和 Rubisco 活化酶的 分离、提纯

14 2 、材料与方法 2.1 材料 植物材料 植物材料 扬麦 5 号 2.2 试剂与仪器 高速冷冻离心机 液相层析收集系统 垂直板电泳系统 ……

15 2.3 Rubisco 的纯化

16 Rubisco 的纯化

17 2.4 Rubisco 活 化酶的分离纯化 2.4 Rubisco 活 化酶的分离纯化

18 3.2 Rubisco 活化酶的纯化

19 2.5 蛋白质的纯度鉴定 利用非解离聚丙烯酰胺 凝胶电泳和 SDS- 聚丙烯 酰胺凝胶电泳 Rubisco 纯 度鉴定。

20 Rubisco 的纯度鉴定结果 Rubisco 的非解离聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 Rubisco 的 SDS- 聚丙烯 酰胺凝胶电泳结果 97.4 66.2 45 31 20.1 14.4 大亚基 小亚基 Rubisco 标准蛋白 分子量 （ ×1000 ）

21 Rubisco 活化酶的 SDS-PAGE 图 谱 A 为 Rubisco 活化酶 ;B 为标准蛋白 45 000 41 000 Rubisco 活化酶纯度鉴定 活化酶 标准蛋白

22 谢谢！谢谢！