残留除草剂的检测报告人：苏晓卉聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的制备并用于残留除草剂检测  实验原理在非光照条件下，叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫能力，即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生 O 2 ，而绝大多数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。  反应方程式 2H 2 O 2.

残留除草剂的检测报告人：苏晓卉

聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的制备并用于残留除草剂检测  实验原理在非光照条件下，叶绿体具有降解双氧水的抗胁迫能力，即叶绿体束缚酶能催化双氧水分解产生 O 2 ，而绝大多数除草剂对该反应有较强的抵抗作用。  反应方程式 2H 2 O 2 叶绿体束缚酶 2H 2 O ＋ O 2  特点研究了 PVA-SbQ 光聚合物固定化叶绿体膜的性质，结果证明该法固定的叶绿体束缚酶具有活性高、寿命长和使用方便等特点。

聚乙烯醇 — 苯乙烯吡啶聚合固定叶绿体膜的制备并用于残留除草剂检测将叶绿体处理后用聚乙烯醇 - 苯乙烯吡啶 ( PVA -SbQ ) 聚合膜进行固定，得到固定化的叶绿体膜，该膜中叶绿体束缚酶能催化 H 2 O 2 的分解产生氧，而除草剂对该指示反应有抑制作用。利用氧电极，建立了新的用于检测痕量除草剂的电流分析法。  检测痕量除草剂的电流分析法  检测范围所检测的除草剂有阿特拉津、莠灭净、草净津、西玛三嗪、扑草净、敌草隆和百草枯等，检测浓度范围分别为 0.25 ～ 1.75 ， 0.04 ～ 0.70 ， 0.10 ～ 1.10 ， 0.10 ～ 0.80 ， 0.20 ～ 1.80 ， 0.01 ～ 0.12 和 0.006 ～ 0.02mg/L 。

实验部分  叶绿体的提取和固定  实验仪器  氧分析仪及氧电极  组织捣碎机  高速冷冻离心机  BH2 型相差显微镜  超级恒温槽  H-600 型透射电子显微镜  CliniBio-128 o C 酶标仪  UTL1386-3V 型低温冰箱  将新鲜菠菜叶片破碎，分离出叶绿体，测定其中叶绿素的含量。再利用 PVA-SbQ 光聚合技术将叶绿体固定。

实验部分  实验试剂和实验材料 PVA-SbQ 规格如下： SbQ 浓度为 1.34×10 － 2 mol/L ，固态物含量 10.04 ％（质量分数 w ％），聚合度 3500 ，皂化度 88 ％； 2 ， 6 －二氯酚靛蓝（ DPIP ），使用前用水配制成 3×10 － 4 mol/L ；除草剂由原料用 2 ％乙醇溶液配制，并用该乙醇溶液逐级稀释成工作液。其浓度分别为百草枯、敌草隆各 1 mg/L ；阿特拉津、扑草净和莠灭津各 5mg/L 等。实验中所用试剂均为分析纯或生化试剂，实验用水为蒸馏水；菠菜种子为香港的 “ 超级菠菜 ” ，土壤培养 8 星期，株均重 25 g ，晴朗天气上午 9 时取叶。

实验方法氧电极的内充液为 0.5mol/L KCl 溶液。首先用空气饱和 Na 2 CO 3 的蒸馏水和饱和溶液对氧测定仪进行满刻度调节和调零，然后取一片 4mm 2 叶绿体固定化膜（或相同叶绿素浓度的叶绿体悬浮液）放入内体积为 2mL 的反应池中，加入 pH ＝ 7.4 的 Tris-HCl 5×10 -3 mol/L MgCl 2 缓冲溶液 1.5mL ， 0.08mol/L H 2 O 2 100μL ，加水至 2mL 。插入氧电极，反应池外层通 28 o C 恒温循环水，搅拌反应液 3min ，从记录仪上读取放氧量 P 0 。更换反应池中的溶液和固定化膜，用微量进样器加入一定量的除草剂，测量 P ，计算 ∆ P= P 0 - P 。每次测量都使用新的叶绿体固定膜。测定装置如图 1 。

机理讨论与除草剂对叶绿体光合作用 Hill 反应的抑制作用的机理不同，实验中除草剂对叶绿体抗胁迫的抑制作用主要涉及到如下的酶反应：在抗坏血酸过氧化酶（ AA-POD ）的催化作用下， H 2 O 2 被抗坏血酸（ A A ）氧化生成单脱氢抗坏血酸（ MDA ）。 MDA 可通过歧化作用生成 AA 和脱氢抗坏血酸（ DHA ）。而 DHA 在脱氢抗坏血酸还原酶（ DHAR ）的催化作用下，与还原性谷胱甘肽（ GSH ）反应生成 AA ， GSH 被氧化为氧化型谷胱苷肽（ GSSG ）。 GSSG 则在 GR 的作用下利用叶绿体中大量存在的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（ NADPH ）作为电子供体重新生成 GSH 。除草剂在避光条件下的抑制作用主要是通过与 AA-POD 和 GR 等相关酶结合来抑制这些酶的活性。

影响因素叶绿体膜的活性根据测得的 PVA-SbQ 固定化叶绿体膜催化降解过氧化氢产生氧气的速率来计算膜的活性。本实验采用敌草隆作为样品（以下实验除指明外，均采用敌草隆），结果如图 2 。由图 2 可见，保存在 -20 o C 冰箱中的 PVA- SbQ 固定膜 1 个月内活性基本没有改变； 5 个月后，膜活性保留仍超过 50 ％，满足实际测定要求。

影响因素叶绿体膜的活性

溶液 pH 值的影响叶绿体中酶抗胁迫能力在中性和弱碱性溶液中表现最强磷酸盐缓冲液硼酸盐缓冲液 Tris-HCl 缓冲液碳酸氢盐缓冲液溶液 pH 为 7.4 时，除草剂的抑制作用最明显，放氧量差值达最大本实验选择 pH 为 7.4 确定采用 Tris- HCl 缓冲液

温度的影响温度对叶绿体束缚酶对 H 2 O 2 的抗胁迫作用和除草剂对该指示反应的抑制作用都有影响，故对测定结果也有影响。实验表明：在 5 ～ 27 o C ，随温度升高空白溶液和含除草剂体系溶液的放氧量都增大，且 ∆P 也随着增大。但温度高于 27 o C 时，由于空白溶液的放氧量增加过快， ∆P 反而逐渐减小。故选择测定温度为 27 o C 。

 过氧化氢加入量的确定  H 2 O 2 降解酶的量由 PVA-SbQ 固定膜中叶绿体的数量决定，对于厚度固定的叶绿体膜，则由膜面积的大小决定。膜的面积增加，叶绿体浓度增大，产生的氧浓度大，除草剂抑制酶反应引起的 ∆P 也增大，但膜片面积达到 6mm 2 时， ∆P 反而减小。另外，体系的空白值过大时，由于产生的氧浓度太大，易超出仪器量程而使测定范围变窄。故本实验膜片面积选择 4mm 2 。  膜片面积对测定的影响  利用叶绿体束缚酶在无光照的条件下对 H 2 O 2 分解产生氧的反应作为测定除草剂的指示反应，因此， H 2 O 2 的加入量对测定有较大影响。当 H 2 O 2 的量小于 2.4×10 -4 mol/L 时，反应的放氧量小，而使 ∆P 很小，测定的灵敏度较低；当 H 2 O 2 的量大于 6.0 × 10 -4 mol/L 时，反应杯中的氧气产生量太大而使空白值增大，结果导致测定的检测范围很窄。综合考虑各种因素，确定 H 2 O 2 的浓度为 4.0×10 -4 mol/L 。

校准曲线按照实验方法分别测定了不同浓度范围的阿特拉津、莠灭净、草净津、西玛三嗪、扑草净、敌草隆及百草枯的校准曲线，结果如表 1 。由表 1 可见，百草枯测定的浓度最低。

固化与未固化叶绿体活性的差异取含有相同浓度叶绿素的悬浮液和固化膜，分别测出未加除草剂的放氧量 P 0 ，计算（ P 0 - P i ） / P 0 ，结果如表 2 。可见，利用 PVA-SbQ 固定叶绿体膜比用叶绿体悬浮液检测的氧减少率高。即 PVA-SbQ 固定叶绿体膜的活性高，用于除草剂的检测灵敏度高于叶绿体悬浮液。

不同固定方法对叶绿体膜活性的影响取冷藏于 -20 o C 冰箱中的含有相同浓度叶绿素的 PVA-SbQ 固化膜、戊二醛－牛血清蛋白固定叶绿体膜以及海藻酸钙固定叶绿体膜，按照上述实验方法，分别测定它们在放置不同时间时对 H 2 O 2 响应的校正曲线，计算曲线的斜率，结果如表 3 。可见， PVA-SbQ 固定叶绿体膜在不同时间下都具有比其它两种固定化方法更高的活性。

 样品分析  各取 500 mL 农田水样于聚四氟乙烯瓶中，试液经过滤后，加入 10 mL 5 ％ EDTA 溶液。先直接按实验方法测定，未检出其中除草剂的量；再分别加入敌草隆标准溶液使其浓度分别为 0.02 mol/L ， 0.05 mol/L ，测得加标回收率为 89.2 ％～ 98.7 ％。另取室内盆载土壤，喷洒一定量阿特拉津的溶液，混匀后分别称取 25g 样品于 250 mL 锥形瓶中。用本法测定，结果为 0.48μg/L （ n=3 ）；另取部分该土壤样品，用固相萃取－ HCLP 法进行测定，结果为 0.51μg/L 。两结果基本吻合。  重现性  每次测定时更换叶绿体膜片，分别对 0.05mg/L 敌草隆进行测定（ n ＝ 11 ），得 RSD ＝ 5.4 ％。重现性与溶液、温度等测定条件有关，为保证测量的精确度，还应使用大小相同的 PVA-SbQ 膜。

结论实验利用除草剂对叶绿体膜中束缚酶催化 H 2 O 2 分解产生氧的反应的抑制作用，提出测定痕量除草剂的方法。该法灵敏、简便、快速，可用来测定样品中的除草剂残留量。同时，对 PVA-SbQ 固定叶绿体膜的研究表明，该固定法能最大程度地保持叶绿体膜中 H 2 O 2 抗胁迫酶的活性，并且保存寿命长，使用方便。

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