Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης.

Παρουσίαση με θέμα: "Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Κατασκευή cDNA βιβλιοθήκης

2 Αν υποθέσουμε ότι σε κάποιο βακτηριακό κλώνο μιας γονιδιωματικής βιβλιοθήκης έχει εισαχθεί «ανέπαφο» ένα γονίδιο, θα ήταν άραγε δυνατόν το γονίδιο αυτό να εκφραστεί; Μια cDNA βιβλιοθήκη είναι ένα σύνολο βακτηριακών κλώνων που περιέχουν αντίγραφα του ώριμου mRNA όλων των γονιδίων που εκφράζονται σε συγκεκριμένα κύτταρα ( ηπατικά, παγκρεατικά, πρόδρομα ερυθροκύτταρα, κλπ)

3 Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης
1. απομόνωση ολικού ώριμου mRNA από τα κύτταρα- «στόχους» 1 2 ν ώριμο mRNA γονιδίου Χ 2. σύνθεση mRNA – cDNA 3. το υβριδικό μόριο αποδιατάσσεται 4. με καλούπι το cDNA δημιουργούνται δίκλωνα μόρια DNA 5. τα δίκλωνα μόρια εισάγονται σε πλασμίδια

4 6. τα πλασμίδια εισάγονται σε βακτήρια-ξενιστές.
τα βακτήρια καλλιεργούνται σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αντιβιοτικό. προσδιορίζονται τα βακτήρια που έχουν προσλάβει πλασμίδιο Το σύνολο των βακτηριακών κλώνων που περιέχει όλα τα γονίδια που εκφράζονται σε ένα κυτταρικό τύπο, απαλλαγμένα από τα εσώνια τους, ονομάζεται cDNA βιβλιοθήκη. 9. Με ειδική διαδικασία επιλέγεται ο επιθυμητός κλώνος….

5 Στάδια κατασκευής cDNA βιβλιοθήκης
Απομόνωση ώριμου mRNA από τα κύτταρα «στόχους» Σύνθεση complementary DNA: σχηματίζονται υβριδικά μόρια mRNA-cDNA Το mRNA διασπάται με χημικές ουσίες ή αποχωρίζεται από την συμπληρωματική αλυσίδα cDNA με θέρμανση Το cDNA γίνεται δίκλωνο: Τα δίκλωνα μόρια DNA εισάγονται σε πλασμίδια Τα πλασμίδια εισάγονται στα κύτταρα-ξενιστές (μετασχηματισμός βακτηρίων) καλλιέργεια των βακτηρίων σε θρεπτικό υλικό που περιέχει αντιβιοτικό Προσδιορίζονται τα βακτήρια που έχουν δεχθεί πλασμίδιο . επιλογή ενός κλώνου που έχει το επιθυμητό τμήμα DNA με ειδική διαδικασία animation

6 Αντίστροφη μεταγραφάση DNA πολυμεράση Μια περιοριστική ενδονουκλεάση
Ποια ένζυμα και με ποια σειρά συμμετέχουν στην κατασκευή μιας cDNA βιβλιοθήκης; Αντίστροφη μεταγραφάση DNA πολυμεράση Μια περιοριστική ενδονουκλεάση DNA δεσμάση