Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας

Παρουσίαση με θέμα: "Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας
Εθνικό και Καποδιστριακό Πανεπιστήμιο Αθηνών Σχολή Θετικών Επιστημών Τμήμα Βιολογίας Τομέας Βιοχημείας και Μοριακής Βιολογίας Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας Μέρος 4ο Χρήστος Κ. Κοντός, Ph.D. Επίκουρος Καθηγητής, Τμήμα Βιολογίας, Ε.Κ.Π.Α.

2 Τεχνικές της Μοριακής Βιολογίας
Ενότητες Νουκλεϊκά οξέα: Βασικές μέθοδοι Πρωτεΐνες Αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών και νουκλεϊκών οξέων

3 Νουκλεϊκά οξέα: Βασικές μέθοδοι
Έννοιες Αντίστροφη μεταγραφή (reverse transcription, RT) Συμπληρωματικό DNA (complementary DNA, cDNA) Ολιγονουκλεοτίδια (oligonucleotides) Φωσφοαμιδίνες (phosphoamidines) Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (polymerase chain reaction, PCR)

4 Απομόνωση RNA Απομόνωση (εκχύλιση) ολικού RNA από
κύτταρα, ιστούς, βακτήρια, ζύμες / μύκητες, φυτά κλπ. με χρήση διαλύματος χημικών (TRIzol, TRI Reagent, Accuzol κ.ά.)

5 Απομόνωση RNA Απομόνωση (καθαρισμός) ολικού RNA από
κύτταρα, ιστούς, βακτήρια, ζύμες / μύκητες, φυτά κλπ. με χρήση στηλών (spin columns)

6 Απομόνωση RNA Απομόνωση (καθαρισμός) ολικού RNA ή
κλασμάτων RNA (small vs. large) με χρήση στηλών (spin columns)

7 Απομόνωση (καθαρισμός) ολικού RNA από ορό / πλάσμα αίματος

8 Απομόνωση RNA Καθαρισμός (εμπλουτισμός) εξωσωματίων (exosomes)
από αίμα ή ούρα και απομόνωση ολικού RNA με χρήση στηλών (spin columns)

9 Καθαρισμός μη ριβοσωμικού RNA
μη ριβοσωμικού RNA (rRNA-depleted RNA) (αρνητική επιλογή)

10 Καθαρισμός poly(A) RNA
Απομόνωση (εμπλουτισμός) poly(A) RNA με oligo-dT (θετική επιλογή)

11 Απομόνωση (εμπλουτισμός) microRNA με ιχνηθέτες
(θετική επιλογή) Απομόνωση miRNA που συνεντοπίζεται με την AGO2 (σύμπλοκα RISC)

12 Νουκλεϊκά οξέα: Βασικές μέθοδοι
Κατασκευή βιβλιοθήκης συμπληρωματικού DNA (cDNA).

13 Αντίστροφη μεταγραφή

14 Κατασκευή βιβλιοθήκης cDNA.

15 Νουκλεϊκά οξέα: Βασικές μέθοδοι
Κατασκευή βιβλιοθήκης συμπληρωματικού DNA (cDNA). Χημική σύνθεση καθορισμένων αλληλουχιών DNA.

16 Πρωτονιωμένος φωσφοροαμιδίτης.

17 Νουκλεϊκά οξέα: Βασικές μέθοδοι
Κατασκευή βιβλιοθήκης συμπληρωματικού DNA (cDNA). Χημική σύνθεση καθορισμένων αλληλουχιών DNA. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) ενισχύει DNA μέσω επαναλαμβανόμενων κύκλων αντιγραφής DNA in vitro.

18 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR):
Αρχή της μεθόδου.

19 PCR αντίστροφης μεταγραφής (RT-PCR).

20 Παραλλαγές της PCR Hot-start PCR

21 Aptamer-based Hot-start PCR

22 Παραλλαγές της PCR Nested PCR

23 Σύγκριση της nested PCR (αριστερά) με τη semi-nested PCR (δεξιά).

24 Πολλαπλή PCR (multiplex PCR).

25 Πολλαπλή PCR (multiplex PCR).

26