Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος

Παρουσίαση με θέμα: "Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος
Άσκηση 3 Απομόνωση και Tαυτοποίηση Κυττάρων του Ανοσοποιητικού Συστήματος Ρ. Τσιτσιλώνη, Π. Παπαζαφείρη, Α. Φωτεινοπούλου, Σ. Παπαβασιλείου

2 κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών)
Έμμορφα στοιχεία του αίματος μυελική σειρά κοινό αρχέγονο πολυδύναμο κύτταρο (μυελός των οστών) μονοβλαστική σειρά λεμφική σειρά

3 Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος
Θύμος ?

4 Απομόνωση μονοπύρηνων αίματος
Επιστίβαση πλάσμα PBMC Ficoll-Paque

5 Μέτρηση μονοπύρηνων αίματος
Ανάμειξη PBMC με Trypan blue

6 Αιμοκυτταρομέτρο (πλάκα Neubauer)
(1/5x1/5x1/10) 1x1x1/10

7 Προέλευση εμμόρφων στοιχείων του αίματος
?

8 Mορφολογία μακροφάγων

9 Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων
Σινική μελάνη

10 Δ1: Απομόνωση λεμφοκυττάρων
Σε γυάλινο σωληνάριο βάζουμε: 3 ml Ficoll-Paque Επιστιβάζουμε προσεκτικά 4 ml αίματος αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Φυγοκέντρηση: 1800 στροφές, 20 λεπτά Αφαιρούμε προσεκτικά το πλάσμα με πιπέττα Pasteur (πετάμε) Συλλέγουμε τη στιβάδα των λεμφοκυττάρων/PBMC με την ίδια Pasteur Μεταφέρουμε τα λεμφοκύτταρα/PBMC σε πλαστικό σωληνάριο (λεμφοκύτταρα) Προσθέτουμε ΧΧ ml διάλυμα αλάτων (όσο χωρά στο σωληνάριο) Φυγοκέντρηση: 1400 στροφές, 10 λεπτά (ξέπλυμα Ficoll) Διαλυτοποιούμε προσεκτικά το ίζημα των λεμφοκυττάρων/PBMC Επαναιωρούμε σε 1 ml διαλύματος αλάτων

11 Δ2: Προσδιορισμός νεκρών-ζωντανών λεμφοκ.
Στο γυάλινο σωληνάριο (χωρίς ένδειξη) αναμειγνύουμε: 0,45 ml εναιωρήματος λεμφοκυττάρων/PBMC 0,05 ml χρωστικής Trypan blue Τοποθετούμε μικρό δείγμα σε πλάκα Neubauer (και στις δύο θέσεις μέτρησης) Στις περιοχές μέτρησης λευκοκυττάρων (τουλάχιστον σε 2/4): μετρούμε τα ζωντανά λεμφοκύτταρα/PBMC (άχρωμα) μετρούμε τα νεκρά λεμφοκύτταρα/PBMC (βαμμένα μπλε)

12 Δ3: Φαγοκυτταρική ικανότητα μακροφάγων περιτοναϊκής κοιλότητας
Θα απομονώσουμε μακροφάγα: Ενίουμε 10 ml φυσιολογικού ορού στην περιτοναϊκή κοιλότητα ποντικού Αναρρόφηση υγρού, συλλογή σε γυάλινο σωληνάκι Φυγοκέντρηση: 1300 rpm για 5 min Επαναδιάλυση σε 0,5-1 ml φυσιολογικό ορό και μέτρηση Θα προσθέσουμε σε αντικειμενοφόρο πλάκα: 1 σταγόνα εναιωρήματος μακροφάγων στο κέντρο 1 σταγόνα διαλύματος σινικής μελάνης Παρατήρηση στο μικροσκόπιο-εστίαση σε ένα πεδίο-παρατήρηση ανά 15 min Χρόνος χρωματισμού μακροφάγου ~ 1-5 sec Χρόνος αποχρωματισμού μακροφάγου ???

13 Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (Ι)
Δ1: αριθμός λεμφοκυττάρων/PBMC ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος για την ομάδα σας θεωρητικός υπολογισμός αναλυτικά Δ2: αριθμός ζωντανών λεμφοκυττάρων/PBMC αριθμός νεκρών λεμφοκυττάρων/PBMC % αναλογία ζωντανών-νεκρών για την ομάδα σας Δ3: σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση χρωστικής χρόνος αποχρωματισμού για την ομάδα σας

14 Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙ)
Για το φυλλάδιό σας Άσκηση: Πόσα λεμφοκύτταρα/PBMC θα έπρεπε θεωρητικά να έχετε μετρήσει στο ένα τετράγωνο (0,1 mm3) της πλάκας Neubauer? Λεμφοκύτταρα/PBMC ανά mm3 και ανά ml αρχικού αίματος όπως τα μετρήσατε στο δείγμα σας % αναλογία ζωντανών και νεκρών λεμφοκυττάρων/PBMC στο δείγμα σας Σχεδιασμός μακροφάγου πριν και μετά τη χορήγηση σινικής μελάνης 5. Χρόνος αποχρωματισμού (ή ποσοστό περίπου) του μακροφάγου

15 Αποτελέσματα – Υπολογισμοί (ΙΙΙ)
Θεωρητική άσκηση: Έχω 4 ml αίμα ανθρώπου αραιωμένου 1:1 με διάλυμα αλάτων Διαχωρίζω επιστοιβάζοντας το αίμα σε 3 ml Ficoll-Paque Ξεπλένω με 8 ml διάλυμα αλάτων Επαναιωρώ σε 1 ml διάλυμα αλάτων Παίρνω 0,45 ml εναιώρημα PBMC + προσθέτω 50 μl χρωστικής Trypan blue Mετρώ σε 1 πλευρικό τετράγωνο (0,1 mm3) της Neubauer Αν δεν έχω πουθενά απώλειες, πόσα PBMC θα μετρήσω ???? Ξέρουμε ότι: ο άνθρωπος έχει WBC / mm3 αίματος από τα WBC: το 31,5% είναι λεμφοκύτταρα, το 1,5% βασεόφιλα, το 63% ουδετερόφιλα, το 0,5% ηωσινόφιλα και το 3,5% μονοκύτταρα