Virusi prof. dr Biljana Nikolić

Παρουσίαση με θέμα: "Virusi prof. dr Biljana Nikolić"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Virusi prof. dr Biljana Nikolić

2 Opšte osobine: građa, podela, otkriće, životni ciklus
Bakteriofagi – virusi bakterija (litički i lizogeni ciklus) Virulentni virusi – T4 fag Umereni virusi – λ fag Jednolančani DNK fagi RNK fagi Mehanizmi odbrane ćelijskog genoma od strane DNK (virusnog porekla) - restrikcija i modifikacija, CRISPR sistem Virusi arhea Virosfera i viralna ekologija Evolutivni značaj

3 Opšte osobine virusa Najmanji i najjednostavniji mikroorganizmi
Nemaju ćelijsku građu – acelularni su Virusna čestica – virion Virion je na granici veličine makromolekula ( nm) Van ćelije su metabolički inertni (neaktivni) Obligatni intracelularni paraziti (obavezno parazitiraju u ćeliji) - u ćeliji koriste metabolički aparat (enzime, ribozome) i energiju domaćina za sopstvenu reprodukciju Ubrajaju se u žive organizme jer poseduju genetičku informaciju za sopstvenu reprodukciju Jedna čestica virusa, u jednom ciklusu razmnožavanja, može dati preko hiljadu novih virusnih čestica

4 Građa viriona Nukleinska kiselina (DNK ili RNK)
Kapsid, proteinske prirode, izgrađen iz strukturnih jedinica – kapsomera Nukleinska kiselina i kapsid grade nukleokapsid Kod nekih virusa postoji dodatni omotač poreklom od citoplazmatične membrane prethodnog domaćina i specifičnih virusnih proteina uronjenih u membranu U nukleokapsid mogu biti upakovani enzimi neophodni za inicijalne faze infekcije; sintetišu se i pakuju u ćeliji, prethodnom domaćinu (nikada nemaju kompletan enzimski sistem potreban za umnožavanje virusa, uvek koriste i domaćinove enzime i strukture)

5 Podela virusa Prema domaćinu na kome parazitiraju:
Virusi Bacteria (bakteriofagi) Virusi Archaea Virusi Eukarya (virusi protozoa, gljiva, animalni i biljni) Prema morfologiji virusne čestice... Prema tipu nukleinske kiseline... Prema strategijama reprodukcije koje koriste tokom infekcije...

6 Nukleinske kiseline virusa
DNK ili RNK jednolančana ili dvolančana cirkularna ili linearna neki RNK genomi su segmentirani

7 Proteinski omotač – kapsid
Izgrađen od kapsomera Kubna, spiralna ili kompleksna simetrija Spiralna tipična za biljne viruse Animalni virusi imaju veliku varijabilnost u obliku kapsida (ikosaedarna ili spiralna simetrija, nikada nije kompleksna) Kompleksna je tipična za bakteriofage(postoje i virusi arhea) – kombinacija spiralne i kubne kapsidni protein kapsomera (5 proteina) kapsid (12 kapsomera)

8 Kubna (ikosaedarna) simetrija
papova virus (dsDNK) polio virus (+ssRNK) Adenovirus (dsDNK)

9 Spiralna simetrija - TMV virus

10 Kompleksna simetrija Bakteriofag λ Bakteriofag T4 Bakteriofag Mu

11 Virusi sa omotačem Najčešće animalni virusi Influenca virus
Spoljašnji omotač je poreklom od citoplazmatične membrane domaćina, ali su uronjeni i virusni proteini Na površini se uočavaju ’šiljci’, izgrađeni iz virusnih glikoproteina Kod influenca virusa to su: hemaglutinin, koji se vezuje za ćelijske receptore (prepoznavanje domaćina) neuraminidaza, enzim koji olakšava oslobađanje iz ćelije (napuštanje domaćina) i razgrađuje glikoproteine i glikolipide vezivnih tkiva Influenca virus

12 Klasifikacija virusa Podela prema domaćinu:
virusi Bacteria, Archaea i Eukarya (animalni, biljni, protozoa, gljiva) Klasifikacija prema nukleinskim kiselinama i prema načinu replikacije Klasifikacija u taksonomske kategorije najpre je počela da se koristi kod animalnih virusa, najčešće do nivoa familija; familija dobija ime sa nastavkom viridae, rod ima nastavak virus, a vrsta dobija naziv prema bolesti koju izaziva.

13 Replikacija virusa i klasifikacija po Baltimoru
‘+’ lanac RNK služi kao iRNK ‘-‘ lanac RNK je matrica za sintezu iRNK (komplementaran je iRNK) ‘+’ lanac DNK je istog smisla kao i iRNK; služi kao matrica za sintezu ’-’ lanca (dvolančana replikativna forma), a onda ’-’ lanac DNK služi kao matrica za sintezu iRNK

14 Enzimi u virionu Uloga u početnim fazama infekcije
DNK polimeraza ili RNK polimeraza Reverzna transkriptaza (retrovirusi) Lizozim (bakteriofagi) Sintetišu se u prethodnom domaćinu i pakuju u kapsid

15 Otkriće virusa 1892. – ruski naučnik Ivanovski ispituje mozaičnu bolest duvana i traga za uzročnikom Ekstrakt obolelih listova i nakon filtracije ima sposobnost izazivanja bolesti Kraj XIX veka: Postoje ’agensi’ koji dovode do različitih oboljenja, a koji prolaze kroz bakteriološke filtre (filtrabilni su) - manjih su dimenzija od ćelija bakterija Naziv virus = ’živi otrov’

16 Otkriće virusa 1892. Ivanovski (Ивановский), filtrabilni uzročnik mozaične bolesti duvana (otkriće biljnih virusa) 1898. Bejerink (Beijerinck), potvrdio eksperimente Ivanovskog i dao naziv ’virus’ – živi otrov 1898. Lefler (Loeffler) i Froš (Frosch), filtrabilni uzročnik slinavke i šapa (otkriće animalnih virusa) 1909. Landštajner (Landsteiner) i Poper (Popper), filtrabilni uzročnik dečije paralize; otkriće poliovirusa 1915. Tvort (Twort) i Derel (d’Herelle), otkriće bakteriofaga – virusa koji napadaju bakterije Dugo priroda virusa nije bila poznata; znalo se da su manjih dimenzija od bakterija i da izazivaju različita oboljenja. Vizuelizovani su sa otkrićem elektronskog mikroskopa.

17 Životni ciklus virusa (litički ciklus – reproduktivni)
Adsorpcija Penetracija Replikacija sinteza nukleinske kiseline sinteza proteina kapida Sazrevanje (maturacija) Oslobađanje iz ćelije

18 Adsorpcija i penetracija virusa
Adsorpcija na specifične receptore Kod bakteriofaga najčešće ulazi samo genom (penetracija – prodiranje) Animalni i biljni virusi ulaze sa kapsidom (translokacijom, endocitozom, fuzijom membrane sa dodatnim omotačem virusa, posredstvom insekata) i nukleinska kiselina se oslobađa u ćeliji

19 Sazrevanje i oslobađanje iz ćelije
Pakovanje nukleinske kiseline u kapsid Sklapanje kapsida “self assembly” proces, ponekad učestvuju šaperoni Oslobađanje lizom ćelije Prolaskom kroz citoplazmatičnu membranu bez lize Pupljenjem (virusi sa omotačem)

20 Metode studiranja virusa
Elektronska mikroskopija (moć razdvajanja 0,4-1 nm) – determinacija morfologije virusnih čestica (veličina nm) Imunološke metode – reakcije antigen-antitelo korisne za identifikaciju virusa u ćelijama i tkivima i za određivanje srodnosti i klasifikaciju virusa Izolacija nukleinskih kiselina i proteina – biohemijske metode izučavanja Izučavanje interakcije virusa i ćelije domaćina – gajenje virusa na bakterijama domaćinima

21 Određivanje broja virusa
Plaka bakteriofaga – golim okom vidljiva manifestacija umnožavanja virusa na bakterijskom tepihu; Rezultat više puta ponovljenog sleda događaja – infekcije ćelija, replikacije i oslobađanja novih virusnih čestica (klon jedne virusne čestice, analog koloniji bakterija) Postoje svetle i mutne plake

22 Životni ciklus bakteriofaga

23 Bakteriofagi T2, T4 λ (lambda) φX174 M13, fd MS2 φ6

24 Virulentni virusi Umereni virusi
Sa domaćinom isključivo ulaze u litički ciklus Rezultat razmnožavanja po pravilu je liza ćelije i oslobađanje velikog broja fagnih partikula Na bakterijskom tepihu daju svetle plake Umereni virusi Sa domaćinom ulaze u litički ili lizogeni ciklus Rezultat litičkog ciklusa je liza ćelije i oslobađanje velikog br. fagnih partikula Rezultat lizogenog ciklusa je lizogena bakterija u kojoj je virus u stanju profaga; lizogena bakterija se umnožava i svaka ćerka ćelija u sebi nosi profag Profag je integrisan u hromozom domaćina (λ fag) ili je ekstrahromozomalna DNK (P1 fag) Na bakterijskom tepihu daju mutne plake Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u litički ciklus Lizogena konverzija – domaćin stiče nova svojstva kodirana genima profaga (pr. Corynebacterium diphteriae)

25 T4 bakteriofag Genom dvolančana linearna DNK sa terminalnim ponavljanjem (geni na krajevima DNK su prisutni u dve kopije (jedna kopija na jednom kraju, druga na drugom), kodira 250 proteina, kapsid je kompleksan, izgrađen iz 25 proteina Kompleksne simetrije: glava izduženi ikosaedar, kontraktilan repić sa bazalnom pločom i dugim kukicama Virulentni virus: sa domaćinom stupa u litički ciklus, lizira ćeliju i oslobađa se oko 100 novih virusnih čestica

26 Životni ciklus T4 bakteriofaga
Rani proteini (preko 20): nukleaze (isecaju DNK domaćina), specifična virusna DNK polimeraza, enzim za sintezu 5-hidroksimetilcitozina, enzim za kovalentnu modifikaciju RNK polimeraze domaćina tako da transkribuje srednje i kasne virusne gene (rane gene prepoznaje σ70 faktor domaćina) Srednji proteini: novi σ faktori koji omogućavaju RNK polimerazi da prepozna kasne gene Kasni proteini: proteini kapsida i lizozim

27 Replikacija i pakovanje nukleinske kiseline
Replikacija genoma u linearnoj formi Formiranje konkatemera rekombinacijom (džinovski molekuli DNK) Pakovanje u glavu dok se ne napuni – headhful mehanizam (staje više od veličine genoma) Terminalno ponavljanje (pojedini geni su duplirani i nalaze se na oba kraja genoma) i cirkularna permutacija (koji će geni biti ponovljeni zavisi od mesta zasecanja, na različitim fragmentima to su različiti geni)

28 LAMBDA (λ) fag Umereni virus, sa domaćinom može ući u lizogeni ili litički ciklus Kompleksan kapsid: glava i nekontraktilni rep bez kukica Genom: linearna dvolančana DNK sa jednolančanim komlementarnim krajevima (12 nukleotida, cos mesta = ‘cohesive sites’), u ćeliji se cirkularizuje

29 Genom λ faga se integriše u hromozom domaćina rekombinacijom specifičnom za mesto
Homologija između kratkih regiona attP i attB Enzim Int (mesto specifična nukleaza/integraza) Integracija između gena gal i bio

30 Životni ciklus λ faga Litički ciklus: Faza replikacije virusa
Faza maturacije virusa Liza ćelije i oslobađanje novih viriona Lizogeni ciklus: Virusna DNK je profag integrisan u hromozom domaćina Ćelija je lizogena, imuna na ponovnu infekciju istim tipom virusa Ekspresija virusnog represora CI sprečava ekspresiju drugih gena i ulazak u litički ciklus Lizogena indukcija – prelazak iz lizogenog u litički ciklus

31 Regulacija ulaska u litički/lizogeni ciklus
U početku se sintetišu rani proteini uključeni i u litički i u lizogeni ciklus Ključna uloga dva represora Cro – represor, kada ga ima dovoljno fag ulazi u litički ciklus CI – represor λ faga, ključan za održavanje virusa u lizogenom ciklusu

32 Zašto ulazak u litički/lizogeni ciklus zavisi od energetskog stanja u ćeliji?
Protein CII je rani protein, neophodan je za sintezu represora CI i ulazak u lizogeni ciklus. Njegova stabilnost zavisi od proteina CIII, a ona zavisi od količine ćelijskih proteza koje omogućavaju njegovu razgradnju. Energetsko stanje u ćeliji dobro, intenzivan metabolizam ↓ Ima dovoljno proteaza, nema CIII, nema ni CII ni CI represora Litički ciklus Energetsko stanje u ćeliji loše, metabolizam usporen ↓ Nema dovoljno proteaza, CIII stabiliše CII, a on omogućava sintezu CI represora Lizogeni ciklus

33 Litički ciklus λ bakteriofaga
Replikacija DNK virusa Najpre θ replikacija, kasnije rolling circle pakovanje isecanjem cos mesta

34 Lizogeni ciklus λ bakteriofaga
Za lizogeni ciklus neophodni proteini Int (integraza, omogućava ugradnju profaga u hromozom domaćina), CII i CIII, CI. Potrebno da se sintetiše λ represor (CI) i zaustavi transkripcija svih gena osim sopstvenog CI represor λ faga Stabilno vezan za operatorska mesta virusnih gena ↓ Onemogućena je sinteza proteina neophodnih za litički ciklus - virus ulazi u lizogeni ciklus. Ukoliko dođe do ponovne infekcije istorodnim tipom faga, represor se odmah vezuje za operatorska mesta njegovih gena i sprečava njihovu ekspresiju, a to znači imunost na ponovnu infekciju istim tipom faga.

35 Lizogena indukcija Izvlačenje profaga iz hromozoma domaćina i prelazak u litički ciklus, omogućen je razgradnjom λ represora. Za izvlačenje profaga neophodan je produkt xis gena – ekscizionaza) Spontan proces se retko dešava, ali je moguće indukovati ga agensima koji oštećuju DNK (UV, X, γ zračenje, hemijski mutageni). U slučaju oštećenja DNK dolazi do indukcije specifičnog ’SOS’ odgovora u ćeliji, što vodi razgradnji CI represora λ faga. Skidanje CI represora ima za posledicu otključavanje litičkih gena faga, tj. prelazak u litički ciklus.

36 φX174 bakteriofag cirkularna ’+’ ss-DNK, ~ 5400 nt
geni koji se preklapaju (‘overlapping genes’), fenomen da sa istog nukleotidnog zapisa započinje transkripcija različitih gena (sa različitih mesta i iz različitih okvira čitanja) kodirano 11 proteina ikosaedarni kapsid, 60 kapsomera (25 nm veličine)

37 Životni ciklus φX174 bakteriofaga
Replikacija zavisna od enzima domaćina Replikativna ds forma, teta replikacija Transkripcija minus lanca daje policistronske iRNK Formiranje genoma - replikacija po tipu kotrljajućeg obruča Pakovanje i oslobađanje lizom ćelije

38 Replikacija φX174 bakteriofaga

39 Filamentozni M13 bakteriofag
Cirkularna ’+’ ss-DNK Filamentozni fagi Adsorbuju se na pilus F+ ćelije E. coli Pakovanje u kapsid pri izlasku iz ćelije (pupljenjem, ne ubija ćeliju domaćina) Nema lize ćelija – nema plaka, već prosvetljenja na tepihu bakterija

40 RNK bakteriofagi Bakteriofag MS2 φ6 bakteriofag
Ikosaedarni kapsid (25 nm) ’+’ ss RNK genom od 3569 nt (RNK se koristi kao iRNK) Geni koji se preklapaju kodiraju 4 proteina: RNK replikazu (deo), protein kapsida, maturacioni protein i protein za lizu ćelije domaćina Adsorbuje se na pilus F+ ćelije E.coli φ6 bakteriofag Segmentirani dvolančani RNK genom Parazitira na Pseudomonas syringae

41 Odbrana ćelije od virusne infekcije 1
Odbrana ćelije od virusne infekcije 1. restrikciono-modifikacioni sistem Bakterije sintetišu enzime - restrikcione endonukleaze Seku dvolančanu DNK virusa (stranu DNK) na specifičnim sekvencama (ssDNK i RNK virusi nisu osetljivi) Bakterijska DNK je modifikovana (najčešće metilacija ili glikozilacija) i nije osetljiva na sopstvene restrikcione enzime (restrikciono- modifikacioni sistem) Bakterije poseduju specifične restrikciono- modifikacione sisteme (npr. E.coli linije K i B ih imaju) Virusi se brane od restrikcionih endonukleaza modifikacijom sopstvene DNK koja je istog tipa kao modifikacija DNK domaćina. Npr. T4 fag: modifikacija citozina u 5- hidroksimetil citozin

42 Odbrana ćelije od virusne infekcije 2. CRISPR sistem
Prokariotsko ’imunološko pamćenje’ – sistem koji memoriše sekvence strane DNK koje prodiru u ćeliju CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR region sastavljen od spacers (fragmenti integrisane strane DNK) i repeats (svaki spejser je jedinstven, svi ponovci su isti) Ceo region se transkribuje u jednu RNK Cas proteini (CRISPR asocirani), uloga: integracija spejsera, isecanje RNK u male CR RNK sredinom svake ponovljene sekvence (svaka nosi 1 spejser), isecanje strane DNK koja je obeležena sa CR RNK (prepoznavanje homologije – identične ili slične sekvence) Uloga – zaštita od strane DNK, uključujući fagnu Prisustvo CRISPR sistema dokazano u genomima 90% arhea i 70% bakterija

43

44 Virusi Archaea ATV virus
DNK virusi (dsDNK, linearna ili cirkularna, nekoliko ssDNK) Svi poznati virusi arhea parazitiraju na ekstremofilima Veliki broj različitih morfotipova (kod Archaea opisano 16, kod Bacteria 9) Postoje vrste koje mogu ući u lizogeni ciklus – otkriven je provirus u genomu arhee iz filuma Thaumarchaeota Neobično: ATV virus (parazitira u Acidianus sp., phylum Crenarchaeota) menja morfološki oblik tek pošto napusti ćeliju domaćina; ćeliju napušta kao vretenasta forma bez repića, ex vivo razvija dva duga repa, sa svake strane po jedan) ATV virus

45

46 Virusi Archaea Virusi metanogena i halofila imaju sličnu morfologiju kao T4 fag i linearnu dsDNK Virusi hipertermofilnih Archaea (Sulfolobus, Pyrococcus) imaju neobičnu morfologiju i linearnu ili cirkularnu dsDNK virus PAV1 roda Pyrococcus, ima kratak rep DNK virusi roda Sulfolobus

47 Virosfera i viralna ekologija
Prisutni u svakom staništu u kome ima ćelijskih organizama Virusni metagenom je skup svih virusnih gena u jednom staništu Ukupan br. nadmašuje broj eukariotskih i čak prokariotskih ćelija (1031 virusnih čestica) U morskoj vodi: 106 prokariota i 107 virusa (ali samo 5% ukupne biomase) Najčešći tip virusa u okeanima: dvolančani DNK sa kompleksnom simetrijom Češći su virusi arhea nego virusi bakterija Evolutivni značaj: transdukcijom utiču na bakterijsku evoluciju dovode do lizogene konverzije domaćina kada su u stanju profaga/provirusa

48 Značaj virusa u evoluciji živog sveta
smatra se da je DNK molekul virusnog porekla; prvobitne ćelije - RNK genom; infekcije predačkih linija Archaea, Eukarya i Bacteria DNK virusima uvele DNK u ćeliju DNK je kao stabilniji molekul preuzeo ulogu nosioca naslednog materijala značaj reverzne transkriptaze u evoluciji, za prepisivanje nasledne informacije u DNK