Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:

Παρουσίαση με θέμα: "Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Metode za selektivno izdvajanje i ispitivanje funkcija ćelija prirodnog i adaptivnog imuniteta

2 Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija:
Izdvajanje ćelija U istraživačkom i kliničkom radu najčešće se koriste prečišćene populacije odgovarajućih ćelija Selektivno izdvajanje ćelijskih populacija: Na osnovu različitih fizičkih osobina Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula

3 1. Na osnovu fizičkih osobina (gustina, adhezivnost)
a) Izdvajanje ćelija na gustinskom gradijentu b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti

4 a) Izdvanaje ćelija na gustinskom gradijentu
Različita gustina i težina ćelija Uzorak: periferna krv, tkivni homogenat... Grdaijenti: Ficol, Perkol, Opti prep, Nyco prep... Uslovi razdvajanja: temperatura, rpm, odnos zapremine gradijenta i uzorka (prema preporuci proizvodjača)

5

6 Izolacija mononuklearnih ćelija na gustinskom gradijentu

7 Dobijanje i kultivacija dendritskih ćelija poreklom od monocita
(10%FCS/RPMI + GM-CSF i IL-4) (kultivacija, 6 dana) stimulacija različitim Imunomodulatorima, kultivacija -Ekspresija površinskih markera (protočna citometrija) -Procena alostimulatorne sposobnosti MoDC -Produkcija citokina od strane MoDC -Produkcija citokina od strane T-limfocita u ko-kulturi Ispitivanje fenotpiskih i funkcionalnih karakteristika MoDC

8 b) Izdvajanje ćelija na osnovu adhezivnosti
Adherencija za plastiku ili staklo Adherentne ćelije – makrofagi, DĆ Neadherentne ćelije – T limfociti

9 2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula
Ćelijski markeri: CD3, CD21, CD11c, CD11b... Antitela specifična za ćelijske markere Izvor ćelija: periferna krv, ćelije kosne srži, limfnih čvorova,slezine

10 2. Na osnovu ekspresije različitih površinskih molekula
Metod paninga b) Imunomagnetno sortiranje

11 a) Metod paninga Adherencija za plastične površine obložene antitelima
Direktan paning Indirektan paning

12 b) Imunomagnetno sortiranje
Magnetne kuglice obložene antitelima Direktno imunomagnetno sortiranje Indirektno imunomagnetno sortiranje

13 https://www.youtube.com/watch?v=vEaYuZIx2sg pipeta
ćelija koja ne iskazuje antigen magnetna čestica antitetlo Magnet antigen ćelija koja iskazuje antigen suspenzija ćelija izlaganje magnetu razdvojene populacije ćelija

14 Testovi za ispitivanje funkcija imunskih ćelija
Određivanje broja i vijabilnosti ćelija Testovi za ispitivanje funkcija ćelija prirodnog imuniteta Testovi za ispitivanje funkcija ćelija adaptivnog imuniteta

15 ODREĐIVANJE BROJA I VIJABILNOSTI ĆELIJA
Brojanje ćelija na hemocitometru/ elektronski brojač Tripan plavo Metilensko plavo Kristal-violet test Propidijum jodid MTT test

16 MTT TEST Vijabilnost ćelija odgovara aktivnosti mitohondrija
Kolorimetrijski test: MTT žute boje se u živim ćelijama redukuje u crveno mrki nesolubilni formazan; rastvaranje kristala formazana→ oslobađanje boje, merenje apsorbance

17 TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA PRIRODNOG IMUNITETA
FAGOCITI (MAKROFAGI i NEUTROFILI) NK ĆELIJE

18 FAGOCITI MAKROFAGI NEUTROFILI Produkcija citokina (IL-12, TNFα...)
Fagocitoza Produkcija NO i ROS NEUTROFILI Produkti granula (MPO, elastaza, katepsin G...) - Fagocitoza - Produkcija NO, ROS - Produkcija citokina (IL-1, IL-6...)

19 1. Određivanje sposobnosti adhezije
Ispitivanje adhezije granulocita periferne krvi sa i bez prisustva ConA Kratak opsi procedure: - kultivisati ćelije u mikrotitarskoj ploči (5x106 ćelija/bunariću) u četveroplikatima - dodati PMA (samo u polovinu bunarića) ostaviti da se inkubira 60 minuta pa potom ispranjem toplim PBSom ukloniti neadherentne ćelije - fiksirati adherentne ćelije metil-alkoholom (5-7 min) - obojiti ćelije rastvorom metilenskog plavog (10 min) - isprati boju 3x česmenskom vodom - dodati HCl (200μl, 0,1N HCl) - očitati apsorbancu na 650nm

20 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA
2.TEST FAGOCITOZE čestice obeležene fluorohromom, fagocitoza se detektuje fluorescentnim mikroskopom/FACS 3.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE CITOKINA Vanjćelijska/unutarćelijska detekcija citokina; ELISA testovi, ELISPOT...

21 4.ODREĐIVANJE PRODUKCIJE ROS-NBT test
NADPH oksidaza NBT (oksidovana forma žuta) FORMAZAN (redukovana forma, plav→ sivo-crn) Kolorimetrijski test Intenzitet redukcije NBT-a srazmeran produkciji ROS

22 5. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE NO
Griess-ova reakcija (merenje neorganskog nitrata koji je krajnji produkt oksidacije kratkoživećeg NO) 6. ODREĐIVANJE PRODUKCIJE MIJELOPEROKSIDAZE

23 7. ODREĐIVANJE MIGRACIJE NEUTROFILA (Transwell sistem)

24 NK ĆELIJE Testovi za funkcionalno ispitivanje NK ćelija:
1. Citotoksičnost ( korišćenje tumorskih ćelijskih linija npr. K562 i radioaktivnog 51Cr) 2. Produkcija citokina (INF-γ) ELISA, ELISPOT

25 TESTOVI ZA ISPITIVANJE FUNKCIJE ĆELIJA ADAPTIVNOG IMUNITETA
T limfociti test proliferacije T limfocita in vitro detekcija produkcije citokina test citotoksičnosti B limfociti test proliferacije B limfocita in vitro detekcija produkcije antitela

26 T LIMFOCITI Test proliferacije
Proliferacija stimulisana različitim poliklonskim aktivatorima ili mitogenima limfocita (con A, fitohemaglutimin-PHA,anti-CD3, PMA...) ili specifinim antigenom Proliferativni odgovor se može meriti MTT testom, na osnovu inkorporacije 3H timidina u DNK...

27 -Izolacija mononuklearnih ćelija
-Kultivacija ćelija sa stimulatorom/antigenom 3-5 dana -Pred kraj kultivacije dodavanje radioaktivnog 3H timidina -Merenje radioaktivnosti na sintilacionom brojaču β zračenja

28 MEŠANA LEUKOCITNA REAKCIJA (MLR)
Transplantaciona reakcija Limfociti donora i recipijenta Dvosmerna i jednosmerna MLR

29 Produkcija citokina (ELISA, RIA, PCR...)
ELISPOT

30 Određivanje citotoksične aktivnosti T limfocita
Kokultivacija citotoksičnih T ly sa ciljnim ćelijama (tumorske ćelije,ćelije inficirane virusom itd) koje su obeležene radioizotopom (npr. 51Cr) Nivo oslobođenog radioizotopa je srazmeran citotoksičnom potencijalu ćelija

31 B LIMFOCITI Test proliferacije Produkcija antitela
Isti kao i kod T limfocita (kao mitogen se može koristiti stafilokokni protein A) Produkcija antitela ELISA, RIA, ELISPOT