VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS

Παρουσίαση με θέμα: "VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS

2 9.1. Vienas šūnas kultūras teorētiskā jēga
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija 9.1. VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA   9.1. Vienas šūnas kultūras teorētiskā jēga   Atsevišķa somatiskā šūna kalpo kā modelis, lai pētītu       šūnas un apkārtējās vides savstarpējās attiecības,   attiecības ar saimniekaugu, ar dažādiem patogēniem aģentiem; lai pētītu šūnas uzbūvi, diferenciāciju un dediferenciāciju, bioķīmiju, augstāko augu ģenētiku, u.c.

3 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Vienas šūnas klonu iegūšana sastāv no 2 etapiem:  dzīvotspējīgas vienas atsevišķas šūnas izolēšana,  apstākļu kompleksa nodrošināšana šīs šūnas normālai attīstībai un dalīšanās procesam.

4 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Metodes šūnas izolēšanai:  kallusa iegūšana ar sekojošu suspensiju kultūru radīšanu, kas sastāv no atsevišķām šūnām un nelieliem to agregātiem,  atsevišķo šūnu izolēšana tieši no veselu augu audiem. Kā iegūt atsevišķas šūnas no kallusa, aprakstīts, iegūstot suspensiju kultūru.

5 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Pirmais mēģinājums iegūt vienas šūnas audzēšanu sterilos apstākļos, veikts 1902.g. (Haberlandt). Toreiz tika izmantoti 3 dažādi augi, bet šūnas izdzīvoja tikai 15 dienas Knopa barotnē ar 1-5% saharozi, mazliet palielināja izmērus, bet nedalījās. Vēlākajos mēģinājumos zinātnieki uzlaboja barotnes sastāvu g. Kohlenbach mēģināja audzēt Macleya cordata mezofila šūnas White barotnē, papildus pievienojot 2,4-D un kokosriekstu pieniņu.

6 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Ball un Joshe (1963, 1965) konstruēja speciālu kameru šiem mērķiem. Viņu eksperimentu objekts – Arachis hypogaea dīgļlapju mezofila šūnas. Šai kamerā autori novēroja citoplazmas kustības, šūnas tilpuma palielināšanos. Pēc 14 dienām no vienas šūnas ieguva 30 šūnas. Hloroplasti tajās zaudēja zaļo krāsu, bet palielināja izmērus. Līdzīgus rezultātus šie zinātnieki ieguva ar Aster, Erogeron, Gaillardia un Oenothera lapu šūnām.

7 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Lai audzētu vienu šūnu in vitro, ir vairākas metodes, ko varētu iedalīt 3 grupās:        kultūras-“aukles” metode,        mikrokultūras metode,  pleitinga metode – kultivēšana Petri platītēs uz agarizētas barotnes.

8  Kultūras-“aukles” metode
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija  Kultūras-“aukles” metode Atsevišķas šūnas, kas izolētas ar adatu, cilpu vai mikropipeti no kallusa vai suspensiju kultūras, tiek pārvietotas uz sterila filtrpapīra kvadrātiņiem (apmēram 8x8 mm). 2-3 dienas pirms šūnu izolēšanas filtrus aseptiski novieto virs kallusa-“aukles” audiem, no kuriem izolēs šūnu (vai no līdzīga kallusa). Šāda pirmsapstrāde nepieciešama, lai filtrs samitrinātos un tajā absorbētos barības vielas no “mātes” kultūras.

9 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Pēc šūnas izolēšanas to novieto uz filtrpapīra un to savukārt virs kallusa audiem atpakaļ. To veic ļoti ātri, lai šūna nežūtu. Šī izolētā šūna nekontaktē ar kallusa šūnām, un tomēr difūzijas ceļā caur filtra barjeru saņem no tām barības vielas un faktorus, kas inducē šūnu dalīšanos. Kallusam-“auklei” novecojot, filtru ar šūnu vai šūnu kolonijām pārvieto uz jaunu kallusu. Jebkurā laikā šo filtru var palikt zem mikroskopa un pārbaudīt šūnu dzīvotspēju. Ap 8% šūnu, ko ieguva šādā veidā, dalījās.

10 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Kolonijas, kas sasniegušas 4 mm diametru, pārnes uz agarizētu barotni. Atkarībā no augšanas tempiem, pēc 2-4 nedēļām koloniju sadala un pārnes uz jaunu barotni kā vienas šūnas klonu. Viena no pirmajām kultūrām, ko šādā veidā pavairoja, bija saulespuķe Helianthus annuus; tā auga gan uz saulespuķes, gan uz margrietiņas kallusa. Margrietiņas vienas šūnas kultūra auga tikai uz sava kallusa – 11,5 mēnešus jeb 11 pasāžas, pēc tam to pārnesa uz agarizētu barotni.

11 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Literatūrā aprakstīti labi rezultāti, ja filtrpapīra gabaliņus ar izolēto šūnu novietoja uz agarizētas (0,6%) barotnes, kas saturēja rauga ekstraktu, apkārt kallusa audiem vai arī otrādi – ja kallusa audi bija apkārt. Tas varētu būt tāpēc, ka jaunākās un dzīvākās kallusa šūnas veidojas tieši malās. Ar šo metodi iegūtas daudzu taksonu vienas šūnas kultūras, bet plašu pielietojumu tā nav iemantojusi.

12 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija   Mikrokultūras metode Šīs metodes priekšrocība ir iespēja veikt ilgstošus novērojumus zem mikroskopa, kā šūna aug un attīstās. Šī metode atļauj arī mikrokultūras filmēšanu. Uzsākot kultūru, šūnu suspensiju atšķaida Petri platītē, un no tās ar sterilu mikropipeti uzsūc šķīduma pilieniņu ar vienu šūnu. Tad to ievieto speciālā kamerā vienā pilienā barības šķīduma, kam apkārt ir minerāleļļa. Darbību veic zem mikroskopa.

13 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Līdz 80.-iem gadiem bija konstruētas 4 dažāda tipa mikrokameras. Šīs kameras atšķiras pēc šķīduma novietojuma: 1) - karājošā piliena princips, 2) – sēdošā piliena, 3) kamera ir no speciāla stikla ar plānām sieniņām, kas sevišķi izdevīgi pastāvīgiem novērojumiem zem mikroskopa un 4) – perfūzās kameras. Pēdējām ir divas atveres, kas noslēgtas ar priekšmetstikliņiem; tas dod iespēju periodiski mainīt barības šķīdumu.

14 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija

15 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija  1. Izsēšanas metode Suspensiju kultūru, kas sastāv no atsevišķām šūnām, sajauc ar 35-40º C agarizētu barotni, kas šajā temperatūrā ir šķidrā veidā un izlej Petri platītēs 1 mm plānā slānī. Lai novērstu barotnes izžūšanu un inficēšanos, platītes aizlīmē ar tam paredzēto līmlentu. Suspensijas iegūšanai no atsevišķām šūnām izmanto divkāršo suspensiju filtrēšanu aseptiskos apstākļos ar atšķirīgu filtru poru diametru. Eksistē arī savādākas izsēšanas metodes.

16 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija 2. Plāksnītes-kopijas metode Tā pamatojas uz šūnu augšanu caur sietiņu. Pirmo reizi šī metode tika lietota mikroorganismu replikācijai (Lederberg, Lederberg, 1952), bet augu šūnu kultūrai to pirmo reizi modificēja Schulte un Zenk (1977) objektam Morinda citrifolia.

17 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Standarta barotnei pievienoja 60% barotnes ar 8-dienu vecu Morinda citrifolia kultūru. Izsēšanas blīvums bija 3600 šūnu/ml. Lai replikācija būtu veiksmīga, izsējas blīvumam jābūt minimāli šūnu/ml.

18 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Kad šūnas šādā veidā bija augušas 14 dienas, Petri platītē (tās diametrs – 8,3 cm) ievietoja sterilu neilona sietiņu (8,1 cm diametrā, pavedieni uz 1 cm2) tā, lai tas būtu ciešā kontaktā ar agarizēto barotni un neveidotu krokas. Pēc 20 dienām sietu noņēma un pārvietoja citā Petri platītē ar jaunu agarizētu barotni, uzliekot otrādi – ar augšpusi uz leju. Tādā veidā šūnas no plāksnītes-saimnieka pārnes uz plāksnīti-kopiju.

19 2005. gada 14. aprīlis Sekmīgas replikācijas nodrošināšanai liela nozīme ir sieta īpašībām: atvēruma izmēriem;  siets nedrīkst locīties,  tam jābūt arī pietiekoši smagam, lai kontaktētos ar barotnes virsmu,  tam jāiztur 60 min. autoklāvēšana 120º C režīmā,  jābūt ķīmiski inertam,  sieta šķiedras nedrīkst uzsūkt barības vielas, un  kopumā tas nedrīkst ietekmēt šūnu dzīvotspēju. Sieta caurlaidību izvēlas atkarībā no kultivējamo šūnu izmēriem. 9. lekcija

20 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Metode piemērojama, lai atlasītu šūnas un kolonijas, kas iegūtas no protoplastiem,  mutantiem,  kā arī tādu šūnu atlasei, kas pastiprināti sintezē sekundāros metabolītus.

21 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Izsēšanas efektivitātes paaugstināšana Izmantojot izsēšanas metodi uz agarizētas barotnes, var veidoties situācija, ka kloni var attīstīties no dažādām šūnām. Tas nozīmē, ka liela nozīme ir filtrēšanas precizitātei.

22 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Pētot atšķirības starp vienas šūnas kloniem, kas iegūti no Haplopappus gracilis un Daucus carota ar izsēšanas metodi, konstatēja, ka, lietojot burkānu suspensijas filtrēšanai marli, ieguva 80% vienādu šūnu, bet lietojot zīda audumu – 90%; Haplopappus gracilis attiecīgi – 25% un 30%.

23 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šūnu kolonijas nedrīkst sastāvēt vairāk kā no 2-4 šūnām. Šīs šūnas dalās un attīstās ātrāk nekā atsevišķās šūnas, kas apgrūtina darbu. Un, protams, kā visos darbos ar audu kultūrām, ļoti būtiska nozīme ir barotnes sastāvam, kas katrā atsevišķā gadījumā būs savādāks. Viena un tā paša auga, to pašu šūnu kultivēšanas barotnes atšķirsies pat tādā gadījumā, ja nebūs vienāds izsēšanas blīvums: jo blīvāka suspensija tiek izsēta, jo barotnei var būt vienkāršāka receptūra, un otrādi – jo izsējas blīvums būs mazāks, jo pieaugs nepieciešamība pēc sarežģītākas barotnes sastāva .

24 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Koblitz barotne šūnu kultūrām (sastāvs tuvināts kokosriekstu pieniņam), devas tabulā dotas mg.L-1 Minerālsāļi pēc Hellera recept. Glicīns ,7 Biotīns ,01 Saharoze L-metionīns ,05 Holīns ,0 Agars L-histidīns ,05 Folijskābe ,0 Giberelskābe ,05 L-oksiprolīns ,2 Mezoinozīts ,0 IES ,1 L-lecitīns ,0 Nikotīnskābes amīds 0,5 L-alanīns ,7 L-lizīns ,0 Ca pantotenāts ,1 γ-aminosviestskābe ,0 L-fenilalanīns ,05 Tiamīna hlorīds ,1 L-arginīns ,1 L-prolīns ,9 Riboflavīns ,1 L-asparagīns ,8 L-serīns ,8 Kobalamīns ,0015 L-asparagīnskābe ,7 L-treonīns ,1 Askorbīnskābe ,1 L-glutamīns ,3 L-tirozīns ,05 ... L-glutamīnskābe ,7 L-valīns ,3

25 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Ar atsevišķiem objektiem izpētīts, ka kultivēšanas efektivitāti var palielināt, paaugstinot CO2 koncentrāciju atmosfērā kultivējamā kamerā, kur novietotas Petri platītes, līdz 1%. Atmosfēras sastāvu šai kamerā iespējams regulēt un kontrolēt. Tas veicina ne tikai izsēšanas efektivitātes paaugstināšanu (atsevišķos eksperimentos sēšanas blīvums 500 šūnu/ml bija pietiekams), bet arī samazina rezultātu variabilitāti, kas šādos pētījumos mēdz būt diezgan liela.

26 Piemērs kartupeļu šūnu kultivēšanai (Birgit Berndt)
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Piemērs kartupeļu šūnu kultivēšanai (Birgit Berndt) Šķidrā barotne ar šūnām, slāņa biezums 1 mm Agarizēta barotne    

27 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Vienas šūnas klonu selekcija   Šūnu izsēšana uz agarizētas barotnes ir būtiska metode vienas šūnas klonu fizioloģiskiem un ģenētiskiem pētījumiem.

28 Iespējama apstrāde ar ķīmiskiem reaģentiem un 1 šūnas klona atlase
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Uz Petri platītes ar ~ 1 mm agarizētas barotnes slāņa uzsētas šūnas, no kurām veidojas šūnu kolonijas, kalluss Iespējama apstrāde ar ķīmiskiem reaģentiem un 1 šūnas klona atlase selekcija

29 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šo klonu izolācija parādīja kallusu un suspensiju kultūru heterogenitāti. Vienas šūnas kloni atšķiras pēc auguma,  struktūras,  krāsas,  spējām izmantot barotnes komponenetus, pēc  diferenciācijas,  organoģenēzes potencēm, kā arī pēc dažādu savienojumu  biosintēzes spējām. Šīs šūnas var atšķirties arī ar  ploiditāti. Piemēram, bija iegūti atšķirīgi Atropa beladonna kloni, respektīvi, kam bija dažāds augšanas ātrums, prasība pēc barības elementiem; kas atšķīrās pēc hloroplastu struktūras un daudzuma, u.c.

30 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Lai atlasītu klonus, var veikt iepriekšēju suspensijas apstrādi ar  mutagēnām vielām,  antimetabolītiem,  paaugstinātām sāļu devām, dažādiem fiziskiem faktoriem, kā radiācija,  paaugstināta vai pazemināta temperatūra,  atšķirīgs gaismas spektrālais sastāvs un intensitāte.

31 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šūnu kultūrās var rasties kloni ar vēlamām īpašībām, un šos klonus iespējams atlasīt un pavairot, veidojot izturīgu šūnu līnijas. Piemēram, Eriksson jau 1967.g. tādā veidā ieguva Haplopappus gracilis ar augstu antociānu saturu apstrādē ar ultravioleto starojumu. Carlson (1973) izdalīja tabakas šūnas, kas ir izturīgas pret metionīn-sulfoksamīdu un ieguva reģenerantus, kas savukārt ir izturīgas pret patogēnu Pseudomonas tabaci. Iegūti vienas šūnas tabakas kloni, kam piemīt dažāda izturība pret vīrusu vairošanos šūnā.

32 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Rezumējot izklāstu, kallusa kultūru, suspensiju un vienas šūnas kultūru pielietojums kalpo  noteiktu īpašību pastiprināšanai un vienas šūnas klonu atlasei ar šīm īpašībām, respektīvi, selekcijai in vitro. Gala rezultāts nav tikai teorētisks, tam ir liela komerciāla nozīme.

33 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija 9.2. PROTOPLASTU KULTŪRAS   Protoplasts ir šūna (precīzāk – šūnas daļa) bez šūnapvalka. Lai veidotu protoplastu kultūras, no šūnapvalka atbrīvojas fermentatīvā ceļā.

34 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastu kultūru metode ir viena no visperspektīvākām metodēm ģenētikā, fizioloģijā, virusoloģijā un molekulārā bioloģijā. Pateicoties protoplastu spējai ieņemt sevī makromolekulas un organellas, iespējai protoplastus sapludināt un sekojoši inducēt meristematisko aktivitāti, bet gala rezultātā iegūt veselu reģenerantu, - šī metode ideāli noder augu šūnas modifkācijai un gēnu inženierijai.

35 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Lai risinātu ģenētikas jautājumus, protoplastu kultūras lieto:        somatisko hibrīdu iegūšanai no attāli radniecīgiem vecākiem, kas krustojot nedod dzīvotspējīgus pēcnācējus,          jaunas augu daudzveidības iegūšanai transgenozā ceļā, ievadot protoplastā svešu gēnu vai tā daļu,         neuzņēmības radīšanai pret dažādām slimībām, ievadot protoplastā to genoma daļu, kas atbild par izturību pret vienu vai otru patogēnu, u.c.

36 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Tā kā protoplastiem nav apvalka, tajos vieglāk iekļūst fizioloģiski aktīvās vielas, un mums rodas iespēja novērot primāro augu šūnas reakciju uz tām. Lieto arī savienojumus ar iezīmētiem atomiem, kas ļauj pētīt to metabolismu kontrolējamos apstākļos. No protoplastiem iespējams izdalīt dzīvus un normāli funkcionējošus organoīdus bioķīmiskiem un fizioloģiskiem eksperimentiem. Tā kā protoplastiem šunapvalks atjaunojas nosacīti īsā laikā, tad ir ērti izsekot, kā veidojas celulozes fibrillas.

37 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Tomēr nevar teikt, ka protoplasts pēc savām īpašībām ir identisks šūnai, tikai bez apvalka. Lai kultivētu protoplastus, bieži ir vajadzīgi citi apstākļi un fizioloģiski aktīvās vielas nekā kultivējot atbilstošo šūnu kultūru. Ir izteikta hipotēze, ka, izolējot protoplastus, tiek zaudēta arī daļa plazmolemmas (Prevot, 1977). Tādējādi var tikt zaudēta arī daļa aktīvo komponentu, piemēram, inhibitoru. Tas acīmredzot traucē normālu diferenciāciju.

38 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastus var iegūt no dažādu audu šūnām. Iegūšanas metodes bija divas – mehāniskā un fermentatīvā. Lietojot mehānisko metodi, vispirms izraisīja plazmolīzi un pēc tam izgrieza šūnu. Šī metode bija ļoti darbietilpīga un mazefektīva, tādēļ tā tika maz lietota. Fermentatīvo metodi pirmo reizi pielietoja Cocking (1966).

39 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šūnapvalka sadalīšanai lieto vienu vai vairākus fermentus, kā celulāzi un pektināzi, to preparātus. Populārākie celulāzes preparāti ir “Onozuka” P-3000, P-1500, R-10, “Meicelase P”, driselāze; pektināzes preparāti – “Macerosyme R-10”, “Pectinase”, “Pectinol R-10”.

40 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Fermentus pirms lietošanas sterilizē filtrējot vai nu ar Millipore (poru diametrs 0,45 m) vai ar stikla filtru 3G5. Fermentu veidu, sastāvu un koncentrāciju piemeklē empīriskos eksperimentos katrai augu dažādībai un audu veidam atsevišķi. Piemēram, lai izdalītu protoplastus no lapām, saknēm un veidotājaudiem, varētu lietot “Onozuka R-10” un “Macerozyme R-10” maisījumu, katru 0,1-0,2% koncentrācijā, bet lai izdalītu protoplastus no ziedlapiņām un augu šūnu kultūrām – “Driselase” 0,5-5% koncentrācijā.

41 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastu izdalīšana Protoplastus var izdalīt kā no in vitro, tā no in vivo augiem. Piemēram, in vivo augoša auga lapu serilizē, atdala epidermu un novieto tādā pašā stāvoklī mazā Petri platītē ar plānām sieniņām, lai būtu ērta novērošana caur binokulāro stereoskopisko mikroskopu.

42 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Platītē ir barības šķīdums, kam pievienots osmolītiķis un vajadzīgie fermenti. Kā barības vielu, tai skaitā cukuru, kvalitatīvo un kvantitatīvo saturu, tā arī nepieciešamos fermentus, to koncentrāciju un ekspozīcijas laiku, nosaka empīriskos izmēģinājumos katram taksonam, tā orgānam un audu veidam atsevišķi.

43 2005. gada 14. aprīlis Receptūra/ vielas Daudzums uz 1 l barotnes (15 ml šķīd. uz 1 g svaigiem audiem) Makro-un mikroelementi MS Vitamīni (Uchimiya, Murashige) UM (tiamīns 5x devā) Celulizīns 1 % Macerāze 0,5 % Mezoinozīts 400 mg 2,4-D 0,5 mg NES 1 mg BAP 0,25 mg Kinetīns Mannitols 7 % Glikoze 2 % CaCl2 10 mM pH 5,7 9. lekcija Piemērs barotnei protoplastu izdalīšanai (ekspozīcija 17 h tumsā, autori E.Firoozabady, D.L.DeBoer, obj. Gossypium hirsutum un G. Barbadense 3 ned. vecu augu jaunās lapas)

44 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Ja fermentus pievieno lielākā koncentrācijā, protoplastu izdalīšanās ir ātrāka, bet var tikt bojāta citoplazma. Ja nav speciāla nepieciešamība pēc gaismas, tad Petri platītes ievieto siltumā un tumsā, kas samazina šūnu un protoplastu stresu, un līdz ar to arī palielina to izdzīvotību.

45 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Kad izdalījušos protoplastu daudzums ir pietiekams (zem mikroskopa var veikt arī skaitīšanu), tos kopā ar šķīdumu “atmazgā” no fermentiem. Vispirms suspensiju nolej un filtrē caur sietu, lai atbrīvotos no nevajadzīgām auga daļām, tad centrifugē. To veic vairākas reizes, noņemot vajadzīgo frakciju un tai pievienojot svaigu barības šķīdumu ar kādu no cukuriem vai to maisījumu osmolītiskā koncentrācijā. Tas nepieciešams, lai protoplasts saglabātu apaļo formu, lai tas neizjuktu. Centrifugēšanai jānotiek ļoti maigā režīmā, kā, piemēram, 100 g 1 minūtē (literatūras dati).

46 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Apskatīsim vienu piemēru. Sterilu krizantēmu lapu ar asu skalpeli sagraiza, kā parādīts zīmējumā, un novieto Petri platītē ar iegriezto pusi uz šķīduma virsmas.

47 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šeit ir arī neliels “āķis”: no tādām lapām, kas nepeld pa šķīduma virspusi, bet atrodas šķīdumā, protoplasti neizdalās. Konkrētajā gadījumā bija vajadzīgs šāds šķīduma sastāvs:        1% “Onozuka R-10”,      0,4% dreiselāze,  0,5 mol.L-1 saharoze,      5 mmol.L-1 CaCl2.

48 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Kultūru ievieto tumšā kamerā. Pēc 3 stundām ar Pastēra pipeti ņem šķīdumu un laiž cauri 2 sietiem (kaprona sietus sterilizē autoklāvējot tādā režīmā kā barotnes absolūti plakanā gludā veidā). Vispirms ņem sietu, kam poru diametrs 1000 µ, tad otru - ar poru diametru 100 µ. Beigās pāris pilienu liek uz priekšmetstikliņa un skatās invertētā mikroskopā.

49 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Centrifugēšana: Pirmā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze, centrifugēšana 1000 apgr./1 min. Otrā un trešā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze + MS barotne ar modifikācijām, centrifugēšana 700 apgr./3 min. Dotais variants bija labākais no izmēģinātajiem, kaut gan tas atšķiras no klasiskajiem (piemēram, ar centrifugēšana) (piemērs par krizantēmām ņemts no G.Jakobsones izmēģinājumiem 1986.g. Maskavā).

50 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastu kultivēšana Pēc tam protoplastus izsēj Petri platītēs, parasti šķidrā barotnē, lai tos mazāk bojātu. Dzīvu protoplastu stāvoklis nevar saglabāties ilgi – ja tie izdzīvo, tie veido šūnapvalku un dalās. Tādēļ šis ir brīdis, lai veiktu dažādas manipulācijas ar protoplastiem.

51 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija    Protoplastu kultūras Protoplasts ir šūna bez šūnapvalka. Šīs kultūras pastāvēšana ir īslaicīga, jo dzīvotspējīgie protoplasti visai drīz veido apvalku, sāk dalīties un veido šūnu grupas.

52 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Receptūra/ vielas Daudzums 1 l barotnes MS neorgan. sāļi, modificēti, īpaši > CaCl2, vitamīni UM mezoinozīts 400 mg mannitols 7 % glikoze 2 % galaktoze 0,3 % BAP 0,2 mg kinetīns 2,4-D 0,5 mg NES 1 mg zeatīns glutamīns 1 mM pH ~ ~ ~ ~ Piemērs protoplastu kultivēšanas sākuma barotnei. Šūnu sieniņu reģenerāciju konstatē ar krāsošanu ar Calcofluor White pēc Galbreith (Physiol.Plant. 1981,53: ). (vitamīni: Plant Physiol.1974,54: )

53 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Kad veidojas šūnas un šūnu agregāti, tos izsēj uz agarizētas barotnes. Tādā veidā var labāk izsekot vienas šūnas kolonijas attīstībai. Protoplastus parasti tur kamerā ar augstāku temperatūru nekā citas kultūras – 25-28º C. Barotnes receptūru, kā vienmēr, nosaka empīriskos eksperimentos. Vai būtu vajadzīga tumsa vai neliels apgaismojums, arī tas ir jānosaka eksperimentāli. Lai sekmīgi varētu kultivēt protoplastu un šūnu populāciju, ir jābūt noteiktam kultūras blīvumam – ap līdz uz 1 ml.

54 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Šūnapvalku reģenerācijas ātrums ir dažāds: nelieli protoplasti no meristēmu audiem var sākt reģenerēt šūnapvalku ~ 1,5 stundās, skaitot no kultivēšanas sākuma, bet pilnībā to izveidojot pēc 24 stundām; protoplasti no pieaugušām lapām ir lielāki, pēc 4 stundām var novērot pirmās šūnapvalka reģenerācijas pazīmes nelielai daļai protoplastu. Jaunizveidojušies šūnapvalki nesatur pektīnvielas.

55 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastu sapludināšana Kā jau teikts iepriekš, protoplastus izmanto ģenētiskām manipulācijām. Viena no tām ir attālā hibridizācija protoplastu līmenī: tiek sapludināti divu dažādu, attāli radniecīgu augu protoplasti. Normālā krustošanā ar putekšņiem pārmantojas tikai tēva auga kodola informācija, bet, izmantojot protoplastus, arī citoplazmas ģenētiskā informācija.

56 Protoplastu kultūras Protoplastu saplūšanas rezultātā hibrīds saņem
2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Protoplastu kultūras Protoplastu saplūšanas rezultātā hibrīds saņem ne tikai kodola, bet arī citoplazmas gēnus no tēva auga

57 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Lai sapludinātu protoplastus, tos apstrādā ar NaNO3 un polietilēnglikolu (PEG) paaugstinātā pH un Ca++ jonu klātbūtnē. Lai atvieglotu heterozitātes identifikāciju, var izmantot protoplastus, kas iegūti no viena auga lapas un satur hlorofilu, bet no otra auga – bezkrāsainus, kas, teiksim, auguši audu kultūrās tumsā.

58 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija

59 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Detalizētu metodiku mēs šeit neapskatīsim, bet pieminēsim faktorus, kas traucē iegūt hibrīdu šūnu (Cocking, 1977): 1. viena vai abu protoplastu nestabilitāte pēc apstrādes, kas inducē sapludināšanu, 2. viena vai abu veidu protoplastu izsējas zemā efektivitāte, 3.asinhrona šūnu dalīšanās, 4. nepilnīga protoplastu saplūšana, traucējot lielām vakuolām, 5. dēļ hromosomu pazaudēšanas sekojošo mitožu laikā, 6. dēļ hibrīdās šūnas nespējas izdzīvot pazeminātā suspensijas blīvumā.

60 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Pētījumi ģenētikā un augu fizioloģijā Ir pierādīts, ka eksogēnā DNS var iekļūt citoplazmā un kodolā bez pilnas degradācijas. Ģenētiskās transformācijas izmēģinājumos nepieciešams izslēgt tādus faktorus kā eksogēnās DNS saistīšanu uz membrānām, tās degradāciju citoplazmā ceļā uz kodolu un saistīšanu uz kodola apvalka. Pirmo divu šķēršļu pārvarēšanai izmanto eksogēnās DNS izmantošanu tieši ar kodolu, ko izdala no protoplastiem.

61 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Izolētos protoplastus izmanto arī transkripcijas hormonālās regulācijas pētījumiem augos. RNS sintēze izolētos protoplastos palielinās giberelskābes (G3) ietekmē un maksimāli pieauga gadījumā, kad dīgstu augšana norisinājās G3 klātbūtnē un kad G3 bija barotņu sastāvā, ko lietoja visā protoplastu izolēšanas laikā.

62 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Cits piemērs. Auksīnu iedarbība uz protoplazmu norisinās ļoti ātri: inkubējot tabakas mezofila vai tomātu augļu protoplastus šķīdumā ar IES vai 2,4-D, tie sabrūk. Šāda IES (10-5 mol.L-1) ietekme tiek novērsta, ja šķīdumam pievieno antiauksīnu – 4-hlorfenoksiizosviestskābi. Ar ABS to nevarēja novērst. Tika izteikta doma, ka protoplasti sabrūk tādā gadījumā, ja eksogēnā auksīna koncentrācija ir vienāda ar endogēno. Ar protoplastu palīdzību tiek pētīta arī šūnapvalka veidošanās, u.c.

63 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija Organellu izdalīšana Kodolu izdalīšana. Tos izmanto RNS un DNS sintēzes eksperimentiem, DNS izdalīšanai un analīzei, hromosomu skaitīšanai, u.c. Vakuolu un hloroplastu izdalīšana. Izrādījās, ka izdalītajiem hloroplastiem bija augsta fotoķīmiskā aktivitāte.

64 11.hibrīdās šūnas dalīšanās 12.-13.šūnu agregātu veidošanās 14.kalluss
1.-lapa in vitro un 2005. gada 14. aprīlis 9. lekcija 2.sagraizīta protoplastu (PL) izdalīšanai 3.PL izdalīšana 4.atmazgāšana 5.PL kultūras iegūšana 6.PL sapludināšana 7.PL sapludināšana 8.hibrīdais PL 9.PL kultivēšana 10.šūnapvalka veidošanās. 16.reģenerants in vitro 17.hibrīds ex vitro 11.hibrīdās šūnas dalīšanās šūnu agregātu veidošanās 14.kalluss 15.organogēnais kalluss

65 2005. gada 14. aprīlis Pārtraukums 10 minūtes! 9. lekcija