Биотехнологија Биотехнологија се дефинише као примена традиционалних и/или научних знања у манипулацији (делова) микроорганизама, или ћелија и ткива виших.

Παρουσίαση με θέμα: "Биотехнологија Биотехнологија се дефинише као примена традиционалних и/или научних знања у манипулацији (делова) микроорганизама, или ћелија и ткива виших."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Биотехнологија Биотехнологија се дефинише као примена традиционалних и/или научних знања у манипулацији (делова) микроорганизама, или ћелија и ткива виших организама, тако да они обезбеђују добра и услуге корисне за прехрамбену и друге индустрије и њихове кориснике. Биотехнологија комбинује дисциплине попут генетике, молекуларне биологије, биохемије, ембриологије, цитологије, системске биологије и биоинформатике, као и практичне дисциплине као што су хемијско инжењерство, информационе технологије и роботика. Традиционални приступи у биотехнологији биљака: укрштање и селекција биљака и прскање пестицидима и хербицидима

2 Примене биотехнологије (подела на области)
Боја Области биотехнологије Црвена Здравље, медицина, дијагностика, фармација Жута Прехрамбена биотехнологија и нутриционизам Плава Биотехнологија морских, водених и обалских система; аквакулт. Зелена Биотехнологија биљака, агрикултура и заштита живорне средине Браон Биотехнологија сушних подручја и пустиња Тамна Биолошко оружје, биотероризам Розе Патенти, проналасци, публикације, интелектуална својина Бела Биоиндустрија (организми који производе корисне хемикалије) Златна Биоинформатика и нанобиотехнологија Сива Класична технологија ферментације и процесовања

3 Типови особина које се уводе у биљке
Улазне или произвођачке особине (input traits) Отпорност биљака на хербициде Отпорност на инсекте Отпорност на патогене (биотички стрес): бактерије, гљиве, вируси, нематоде Отпорност на абиотички стрес Повећање приноса Излазне или потрошачке особине (output traits) Нутриционистички унапређене биљке Биљке побољшаног укуса Трајније воће и поврће са бољим карактеристикама сазревања Дуван без никотина Украсно цвеће нових боја, мириса и продужене свежине итд. Посебне особине (value-added traits) – метаболичко инжењерство Терапеутски протеини који се користе у третирању болести или као вакцине Секундарни метаболити Текстилна влакна Биоразградљива пластика Уља која се користе за боје, детерџенте и лубриканте.

4 71% отпорност на хербициде
28% отпорност на инсекте 1 % све остале особине

5 Отпорност на хербицид глуфозинат
Катализује глутамин синтетаза bar Купус (B. oleracea var. sabauda L.) трансформисан bar геном (bialophos resistance gene) помоћу A. tumefaciens AGL1/pDM805. а - Култура нетрансформисаних (лево) и трансформисаних изданака (десно) на селективном медијуму са 10 mg dm-3 L-PPT. б - Трансформисане биљке (десно) и конролне (лево) после прскања са10 cm3 dm-3 Basta®. Слика преузета из Sretenović-Rajičić et al. (2004), уз сагласност аутора.

6 Отпорност на инсекте (ВТ токсин)
плазмид Н N I II III C протеолитичка активација трансформација Bacillus thuringiensis III спорулација активан ВТ токсин I II инсерција у мембрану и олигомеризација спора параспорално тело кристали ВТ R Инсекти осетљиви на ВТ: а- кукурузов мољац (Ostrinia nubilalis); б-памукова совица (Helicoverpa armigera); в- Монарх лептир (Danaus plexippus).

7

8 Генетичко инжењерство
Генетичко инжeњерство, познато и као молекуларно клонирање, генетичка манипулација, технологија рекомбинантне ДНК, па чак и нао „нова генетика“, представља област биотехнологије у којој се гени и природне ДНК секвенце користе као ресурси којима се на различите начине манипулише да би се постигли одређени циљеви како у фундаменталним истраживањима, тако и у примењеним областима. РЕСУРСИ – гени и природне ДНК секвенце АЛАТИ – ензими

9 Основни кораци у ген. инжењерству
Изолација гена од интереса Модификација гена од интереса конструкција генске касете Конструкција вектора и инсерција гена у вектор Трансформација Селекција - сепарација ГМ организама од нетрансформисаних организама Изворни организам Изолација ГОИ Модификација ГОИ Agrobacterium Генска касета Трансформација Вектор (плазмид) Биљна ћелија Трансформисана биљна ћелија Култура биљних ћелија/ткива + Селекција Регенерација Аклиматизација

10 Еукариотски гени и регулација експресије (подсетник)
Епигенетски ф. - модификација хроматина: Ремоделовање хроматина Модификације хистона Метилација ДНК Регулација транскрипције гена Посттранскрипциони процеси у једру: 3’-полиаденилација додавење m7G „шеширића“ Обрада: splicing /alternative splicing Обрт (turnover) РНК Транспорт у цитоплазму Посттранскрипциони процеси у цитоплазми: Обрт - разградња РНК PTGS – посттранскрипционо утишавање Едитовање РНК Ефикасност транслације Посттранслациони процеси Успостављање конформације протеина Ензимске модификације Транспорт и локализација протеина Протеин-протеин интеракције Стабилност/разградња протеина

11 Генске касете Промотор Ген од интереса Терминатор Вектор CaMV 35S
Промотори могу бити хомологни (из исте врсте, истог рода или евентуално исте фамилије) или хетерологни (из удаљених врста) Промотори који се користе у генетичком инжењерству биљака се деле на: Конститутивни промотори Промотори биљних патогена Конститутивни промотори монокотила Индуцибилни промотори Промотори индуковани абиотичким и биотичким стресом Хемијски индуковани промотори Ткивно-специфични промотори Развојно-специфични промотори Синтетички или рекомбинантни CaMV 35S промотор

12 Генске касете Промотор Ген од интереса Терминатор Сигнална секвенца?
Органела Сигнал Напомена Ендоплазматични ретикулум HDEL/KDEL/RDEL мотив Обично на С-терминусу Вакуола LQRD секвенца Понекад није довољна само ова секвенца, већ и одговарајућа конформација да би се сигналне секвенце довеле на површину протеина Нуклеус NSL (nuclear localization signal) Обично мали регион било где у протеину богат базним амино киселинама. Није конзервативан. Неки протеини имају и сигнал за експорт из једра, па могу улазити и излазити. Пероксизоми/ глиоксизоми SKL мотив (S/A/C)(K/R/H)L Хлоропласт N-терминални транзитни пептид Варира, није конзервативан, али је обично богат серином и треонином и нема киселих амино киселина. Протеолитички се одстрањује после транспорта. Митохондрија Варијабилан, али има неких региона хомологије код разних протеина. Обично нема киселих амино киселина. Протеолитички се одстрањује после транспорта.

13 Модификације хетерологних гена
Промотор Ген од интереса Терминатор Хетерологни гени, а посебно гени који не воде порекло од биљака, се често веома слабо експримирају у биљкама чак и кад су под контролом јаког промотора. Промена GC састава - бактеријски гени имају знатно нижи % GC од других. Висок % АТ трансгена интерферира са процесовањем РНК у биљкама, јер су код биљака региони богати са АТ обично интрони. Због тога се овакви трансгени слабо или никако не експримирају у биљци Уклањање криптичних (скривених) интрона - секвенце трансгена које заправо нису интрони, али их биљни системи за обраду РНК погрешно препознају као интроне и исецају их. Ово доводи до делеција у транскрипту трансгена који се у том случају не експримира. Уклањање АТТТА секвенци - код биљака поновци АТТТА односно AUUUA у транскриптима смањују стабилност mRNA Уклањање потенцијалних места за полиаденилацију –бактеријски гени често имају секвенце које биљни системи препознају као сигнале за полиаденилацију у сред транскрипта. Ове секвенце, наравно, прекидају транскрипцију и неопходно их је све уклонити осим једне на крају транскрипта. Оптимизација коришћења кодона Консензусне секвенце у околини AUG кодона неопходне за иницијацију транслације су другачије код биљака него код других врста.

14 Нуклеазе 5’-pNpN↓pNpNpNpN↓pNpN-OH3’  pNpN-OH + pNpNpNpN-OH + pNpN-OH
Нуклеазе се према типу супстрата и начину деловања класификују на следећи начин: Егзонуклеазе (одвајају у главном по један по један нуклеотид са 3’ и/или са 5’ краја ланца) Егзодезоксирибонуклеазе: λ егзонуклеаза, егзонуклеазе I, III и VII, BAL 31 Егзорибонуклеазе Ендонуклеазе (секу у средини ланца) Ендодезоксирибонуклеазе: BAL 31 , DNAse I, рестрикционе ендонуклеазе, nicking ендонуклеазе Ендорибонуклеазе: RNAse H, RNAse A, RNAse T1 Неспецифичне дезокси- или рибо- могу да секу и ДНК и РНК: нуклеаза S1, mung bean нуклеаза, микрококална нуклеаза 5’-pNpN↓pNpNpNpN↓pNpN-OH3’  pNpN-OH + pNpNpNpN-OH + pNpN-OH 5’-pNpNp↓NpNpNpNp↓NpN-OH3’  pNpNp + HO-NpNpNpNp + HO-NpN-OH

15 Нуклеазе Примена Нуклеаза
Уклањање хромозомалне ДНК из препарација плазмида λ егзонуклеаза Секвенцирање: генерисање ssDNA од dsDNA λ егзонуклеаза, Егзонуклеаза III PCR: уклањање прајмера после реакције Егзонуклеаза I, Егзонуклеаза VII Увођење делеција на једном крају ДНК Скраћивање ДНК фрагмената BAL 31 Помоћ у рестрикционом мапирању Мапирање секундарне структуре ДНК Уклањање ДНК из препарата РНК DNAseI DNA footprinting Увођење једноланчаних прекида DNAseI, nicking ендонуклеазе RT: деградација РНК матрице из mRNA:cDNA хибрида RNAse H Уклањање poly(A) репа из mRNA:poly(dT) хибрида Мапирање тачкастих мутација RNAse A Уклањање нехибридизованих делова РНК из ДНК:РНК и РНК:РНК хибрида RNAse A, RNAse T1 Анализа ДНК:РНК хибрида Нуклеаза S1 mung bean нуклеаза Поравњавање 3' и 5' једноланчаних крајева на ДНК Поравњавање 5' једноланчаних крајева на ДНК Уклањање нуклеинских киселина из препарата протеина микрококална нуклеаза Анализа хроматина

16 Рестрикционо/модификациони системи
Рестрикционо/модификациони (Р/М) системи укључују рестрикциону ендонуклеазу (РЕ, REase) и модификујући ензим- ДНК метилазу одн. метилтрансферазу (MTase). Служе за одбрану ћелије од стране ДНК, омогућавају разликовање домаће ДНК од стране ДНК. РЕ препознаје и сече специфичне ДНК секвенце, док метилаза метилује А или Ц на тим истим секвенцама и штити ДНК домаћина од сопствене РЕ. Додате метил групе залазе у велики жљеб ДНК, чиме спречавају везивање РЕ. РЕ су нађени искључиво код прокариота (и код неких вируса), и то код свих испитиваних бактерија и архебактерија На основу композиције субјединица, места сечења ДНК, специфичности за секвенце и захтева за кофакторима, РЕ се класификују у 4 типа: Тип I - метилаза и РЕ су један комплексан ензим Тип II - метилаза и РЕ се независни једноставни ензими (дели се на 11 подтипова) Тип III - метилаза и РЕ су један комплексан ензим Тип IV - само РЕ који сече страну метиловану ДНК Солитарне метилазе (без РЕ парњака) немају везе са Р/М системима, али њихова метилација може да интерферира са рестрикцијом m5C- 5-метилцитозин hm5C- 5-хидроксиметилцитозин m4C- N4- метилцитозин и m6A- N6-метиладенин

17 Рестрикционо/модификациони системи:
номенклатура Род Escherichia Врста coli Сој/серотип/изолат RY 13 (R. N. Yoshimori) први РЕ из тог соја рестрикциони ензим EcoRI = R.EcoRI ecoRIR М.EcoRI ecoRIM метилаза ензим има и рестрикциону и метилазну активност RМ.Eco57I S.EcoR12I RE типа I имају одвојену субјединицу за специфичности C.EcoRV за неке RE постоје контролни протеини за рег. експресије

18 R/M системи типа II – важне ствари
До сада откривено преко 3500 ових ензима. Како се откривају? Једноставан есеј: свака ензимска активност која даје константну шему фрагментације одређене ДНК је по дефиницији РЕ типа II. Континуално или дисконтинуално место препознавања BamHI (5’ крајеви) BglII (5’ крајеви) KpnI (3’ крајеви) SmaI (равни крајеви) 5'---G GATCC---3‘ 3'---CCTAG G---5' 5'---A GATCT---3‘ 3'---TCTAG A---5' 5'---GGTAC C---3‘ 3'---C CATGG---5' 5'---CCC GGG---3‘ 3'---GGG CCC---5' Дужина места препознавања је важна при избору РЕ, јер од дужине зависи фреквенција рестрикције Изошизомери су два или више РЕ који препознају и секу исту секвенцу: HpaII (C↓CGG) и MspI (C↓CGG) Неошизомер препознаје исту секвенцу као прототип али је сече другачије: AatII (GACGT↓C) и ZraI (GAC↓GTC)

19 R/M системи типа II – примене
Рестрикциона фрагментација (restriction digest) је једна од основних процедура у молекуларној биологији, која се користи да би се геномска или друга ДНК припремила за анализу или неку другу обраду. Ако се два РЕ користе симултано, то је double digest. Делимична фрагментација је partial digest. У оквиру метода: Southern хибридизација, анализе молекуларних маркера типа RFLP, AFLP и VNTR и др. Анализа генотипа- РЕ се могу користити за разликовање генских алела јер могу да препознају промене у појединачним базама (Single Nucleotide Polymorphysms, SNPs) Молекуларно клонирање Рестрикционо мапирање представља одређивање места познатих РЕ у некој ДНК секвенци. Рестрикционе мапе се потом користе као референца током конструкције плазмида или других вектора и генских конструката, за одређивање оријентације инсерта у вектору и друге апликације.

20 ДНК и РНК лигазе ДНК лигазе катализују формирање фосфодиестарских веза на месту једноланчаних или дволанчаних прекида у дуплексу ДНК. Лигазе су много ефикасније у повезивању кохезивних крајева Присуство фосфатне групе на 5' крају ланца је предуслов за реакцију (Т4 полинуклеотид киназа/алкалном фосфатаза) Према типу супстрата и кофактора, лигазе нуклеинских киселина се деле на три групе: АТР-зависне ДНК лигазе NAD+-зависне ДНК лигазе АТР-зависне РНК лигазе  

21 ДНК и РНК лигазе Примена Лигаза
Повезивање кохезивних крајева ДНК при клонирању Т4 ДНК лигаза E. coli ДНК лигаза (Taq ДНК лигаза) (9oN ДНК лигаза) Повезивање равних крајева ДНК при клонирању Качење адаптера и линкера на ДНК равних крајева Поправка једноланчаних прекида у dsDNA Taq ДНК лигаза 9oN ДНК лигаза Поправка једноланчаних прекида у dsRNA Т4 РНК лигаза 2 Повезивање РНК и ДНК у дволанчану структуру Обележавање 3'-крајева РНК Т4 РНК лигаза 1 Повезивање једноланчаних нуклеотида ДНК или РНК Реакција детекције лигазом (Ligase Detection Reaction); Ланчана реакција лигазе (Ligase Chain Reaction) Клонирање microRNAs Т4 РНК лигаза 2 (1-249)

22 Лигација инсерта у вектор
Жељени продукт je фрагмент убачен у вектор. Циркуларизован вектор без инсерта Повезани сами вектори Повезани сами инсерти

23 Полимеризација ДНК (подсетник)
5'3' полимеризна активност

24 Полимеразе Полимеразе су ензими чија је улога полимеризација нуклеинских киселина уграђивањем нуклеотида које у форми NTPa одн. dNTPa узимају из раствора, при чему се ослобађа пирофосфат (PPi). Полимеразе се по функцији и типу матрице деле на: ДНК полимеразе: полимеризација ДНК на основу ДНК мартице. Деле се на репликативне и „repair” полимеразе. Реверзне транскриптазе катализују полимеризацију ДНК на основу РНК мартице; кодиране ретровирусима Терминална трансфераза: полимеризација ДНК продуживањем 3'-крајева РНК полимеразе - транскрипција. Незахвалне за експериментално коришћење (промотори, транскрипциони фактори...), осим у саставу китова за in vitro транскрипцију. РНК-зависне РНК полимеразе Заједничке карактеристике полимераза: Полимеризација се увек одвија у 5’3’ правцу, тј. нуклеотиди се додају на 3'-крај За полимеризацију је неопходан слободан 3'-ОН терминус За полимеризацију је неопходна матрица. Ни једна ДНК полимераза не може да започне de novo синтезу ДНК. Ни једна ДНК полимераза (осим терминалне трансферазе) као матрицу не може да користи интактну дволанчану ДНК, већ само: једноланчану ДНК са хибридизованим олигонуклеотидом - прајмером. дволанчану ДНК са краћим или дужим прекидима једног ланца (gaps) или дволанчану ДНК којој штрчи 5' крај дволанчану ДНК са једноланчаним прекидима (nicks)- само у случају неких полимераза као што је E. coli ДНК полимераза I и њен Klenow фрагмент Неопходни су dNTPs Mg2+ јони су неопходни за све полимеразе.

25 Битне особине по којима се ДНК полимеразе разликују су:
Тачност (fidelity) Брзина (бр уграђених нуклеотида/s) Процесивност (бр уграђених нуклеотида пре дисоцијације од матрице) Матрица - за већину ДНК полимераза је ДНК, а за реверзне транскриптазе је РНК 3’5’ егзонуклеазна активност (proofreading) 5’3’ егзонуклеазна активност (nick translation) Замена ланца (strand displacement) Термостабилност зависи од типа организма из којих је ензим изолован (мезофилни, термофили, хипертермофили) 5'3' полимеризна активност 5’3’ егзонуклеазна активност се користи за методу померања прекида (Nick translation), 3’5’ егзонуклеазана активност је пожељнa за high-fidelity PCR, уклањање 3'-крајева који штрче и синтезу другог ланца, а непожељна је за уградњу нестандардних, модификованим или обележених нуклеотида Замена ланца (strand displacement) је способност полимераза којима недостаје 5’3’ егзо да одлепе један ланац од другог. Ово је корисно за изотермалну амплификацију (Strand Displacement Amplification, SDA)

26 Секвенцирање Поравњавање крајева
Полимераза 3’5’ егзо 5’3’ Замена ланца Фрекв. грешака х10-6 Термо- стабил- ност Примена E. coli ДНК пол I + - 9 Nick транслација Синтеза 2. Ланца Обележавање 3' крајева Klenow фраг. 18 Секвенцирање Поравњавање крајева Синтеза 2. ланца Klenow фраг. 3’5’ еxo- 100 Секвенцирање Обележавање ДНК насумичним прајмерима T4 ДНК пол. 1 Попуњавање прекида Поравњавање крајева Радиоак. обележавање T7 ДНК пол. 15 Копирање дужих сегмената ДНК Sequenase φ29 пол. ++ Изотермална амплификација Bst ДНК пол. +/- / Велики фрагмент Секвенцирање: код GC-богатих региона и малих количина узорка Taq ДНК пол I 285 PCR Високопроцесивни PCR Екстензија прајмера Флуор. обележавање Pfu ДНК пол 1.6 PCR високе тачности VentR® пол. 57 Deep VentR® 20-45 PhusionTM 0.44 PCR- дугачки ампликони клонирање 9°Nm ДНК пол. SNP анализа TherminatorTM Уграђивање модификованих нукл. M-MuLV RT реверзна транскрипција RT-PCR AMV RT секвенцирање РНК Poly(A) пол. додавање/продужавање Poly(A) репа на РНК 3' обележавање РНК Poly(U) пол. φ6 RdRP синтеза дволанчане РНК SP6, T7 и T3 РНК пол. транскрипција

27 Klenow фрагмент

28 Остали ензими Т4 полинуклеотид киназа катализује трансфер γ-фосфатне групе АТР-а на 5'-крај ДНК или РНК, па се користи за фосфорилацију 5'-крајева ако им недостаје фосфатна група, што је предуслов за лигацију. Може се користити и за радиоактивно обележавање крајева нуклеинских киселина ако се као супстрат користи [γ-32Р]АТР Алкалне фосфатазе су Zn2+-металоензими који су најактивнији на рН 8-9, а катализују уклањање 5'-фосфтане групе са ДНК, РНК, rNTP-a и dNTP-a. Системи специфичне рекомбинације (site-specific recombination systems) су изоловани из вируса и бактериофага који могу да се интегрушу у геном домаћина у форми профага, где катализују интеграцију виралног генома и његово извлачење (excision). Ови системи имају широку примену у биотехнологи, а се састоје од ензима рекомбиназе и специфичне секвенце коју дата рекомбиназа препознаје и на коју делује. Од оваквих система се највише користе Cre/Lox, Flp/FRT, R/RS и Int/att.

29 Вектори Плазмиди Бактериофази Хибридни вектори великог капацитета и вештачки хромозоми Трансформација Agrobacterium tumefaciens и природна трансформација биљака Експлоатација A. tumefaciens: бинарни вектори Трансформација помоћу Agrobacterium rhizogenes Хемијска трансформација Електропорација Биолистичка трансформација Селекција Типови селектабилних маркера Негативна селекција: резистенција на антибиотике и хербициде Позитивна селекција Визуелна селекција: лактозни оперон и α-комплементација Репортер гени и генске фузије

30 Ti плазмид/ бинарни вектор Ri плазмид/бинарни вектор
Вектори Вектори за клонирање су ДНК молекули који се користе за транспорт клонираних секвенци између различитих домаћина (бактеријских и биљних ћелија) и епрувете и за конструкцију геномских и cDNA библиотека. Сви лабораторијски и комерцијални вектори морају да имају следеће особине: Могућност аутономне репликације Имају генетички маркер (или маркере) за селекцију Јединствена рестрикциона места за различите рестрикционе ензиме Имају минималну количину неесенцијалне ДНК. Вектор Капацитет (Kb) Домаћин Бр. копија Ti плазмид/ бинарни вектор 5-10 (max 20) A. tumefaciens велики Ri плазмид/бинарни вектор A. rhizogenes Остали плазмиди E. coli λ фаг 20 Козмиди 35-45 Фозмиди 45 1 Р1 70-100 PAC BAC YAC (max 1 Mb) Квасац

31 Плазмиди Плазмиди су екстрахромозомални молекули ДНК величине Kbp, Налазе у бактеријама домаћинима у циркуларној, суперхеликалној форми Репликација и наслеђивање независно од бактеријског хромозома Већина има узак избор домаћина - бактерија Зависни од домаћина у мањој или већој мери – бактерија кодира ензиме и протеине неопходне за репликацију и транскрипцију Одржавају сталан број копија; имају механизме за поделу одређеног бр. плазмида ћеркама ћелијама, као и механизме заштите од других плазмида. Репликон је генетичка јединица која се која се састоји од места почетка репликације (Origin of Replication, ORI) и контролних елемената. Репликон плазмида се дефинише и као сегмент плазмидне ДНК који може аутономно да се умножава и одржава сталан број копија. Често садрже гене који користе домаћину: Резистенција на антибиотике Продукција антибиотика Деградација комплексни органски молекула Продукција токсина – колицин, ентеротоксин и др Продукција рестрикционих и модификационих ензима

32 Шта све пристојан лабораторијски плазмид треба да има?
ОБАВЕЗНО: Репликон и ORI Полилинкер место за клонирање (Polylinker Cloning Sites or Multiple Cloning Sites – MCS). Селектабилни маркер(и) ОПЦИОНАЛНО: Репортер ген LacZa - 5'-крај гена за β-галактозидазу Експресиони вектори имају и прокариотске промоторе (обично из бактериофага T3, T4 или SP6), као и друге неопходне прокариотске 5'-регулаторне секвенце, као што је Shine-Dalgarno секвенца Елементи М13 фага који омогућавају репликацију једноланчане ДНК

33 Типови плазмида У генетском инжењерству се користи 3 типа плазмида:
F+ cell F- cell У генетском инжењерству се користи 3 типа плазмида: Вирулентни плазмиди – кодирају за бактеријске токсине као што су колицини Плазмиди који носе резистенцију на антибиотике Коњугативни плазмиди: F плазмид, F фактор или ЕПИЗОМ: Омогућава бактерији да продукује секс пилус за коњугацију Велики, 1 копија Користе се као основа за конструкцију фозмида и ВАСK За везивање M13 F+ бактерије га имају F- бактерије га немају F’ бактерије имају у њему и додатну, бактеријску ДНК Hfr бактерије имају F интегрисан у геном Ti и Ri Плазмиди – за трансформацију биљака F pl F+ cell F+ cell

34 Стратегија клонирања плазмидима
1. RE дигестија ДНК и плазмида 2. Лигација 3. Трансформација E. coli 4.Селекција 5. Раст бак- 6. Лиза ћелија 7. Изолација плазмида

35 Типови бактериофага Тип геном особине T серија (T4, T7)
Парни и непарни Велики, линеарни dsDNA Само литички циклус. Користе се ензими лигазе и полимеразе, као и промотори Умерени , P1 Линеарна Литички и лизогени циклус Мали сферични ΦX174, Φ29 Циркуларна ssDNA Ензими... Мали филаментозни M13, fd, f1 циркуларна ssDNA За продукцију једноланчаних ДНК матрица РНК бактериофази ssRNA

36 Бактериофаг ʎ ʎ фаг је један од најбитнијих модела организама и алата у генетичком инжењерству Геном ʎ је dsDNA, линеарна док је спакована у главе фага, 48.5 Kb, око 30 гена Крајеви су једноланчани, кохезивни (12 nt) и зову се se cos места.Кад уђе у домаћина, крајеви се залепе и долази до циркуларизације l 48502 bp 30% генома може да се замени PL PRM PR PRE PantiQ PR’ PI attP Глава Реп (135 nm) Конични део (15 nm) и репна нит (23 nm)

37 Литички и лизогени циклус ʎ
E. coli Бактеријски хромозом Везивање фага за бактерију и ињектирање λ ДНК Циркуларизација Интеграција Пролиферација Индукција Синтеза виралних протеина Репликација λ ДНК и паковање Лиза Лизогени циклус Литички циклус Регулација литичког и лизогеног циклуса је веома комплексна, али се у суштини све своди на то који ће од два главна регулаторна гена „преовладати“: cro  литички циклус или cI  лизогени циклус, што зависи од услова раста бактерија, да ли је ћелија под стресом и да ли је дошло до оштећења ДНК. Профаг

38 Зашто је λ фаг добар вектор?
λ може да прими велике инсерте ДНК. Око 15 Kbp, што је скоро трећина генома, може да се исече из централног дела, између гена J и N, и замени са Kbp стране ДНК без утицаја на литички циклус. Међутим, величина ДНК која може да се спакује у главу фага је фиксна и износи % WT генома. Ако је величина ДНК изван ових граница, паковање је неефикасно, или је виталност и инфективност вируса ниска. Много је година и рада уложено у проучавање λ и његове модификације, па постоји цела палета исконструисаних верзија овог вируса. Комерцијални λ обично имају уграђено пуњење од ≈ 15 Kbp (stuffer fragment) које се замењује страном ДНК, па се називају и супституционим векторима. λ је један од неколико организама који могу бити реконституисани у епрувети (in vitro packaging), тако да је могуће једноставно помешати рекомбинантну ДНК са протеинима за главу и реп и инфективне честице ће се саме оформити. Постоје и готови китови за паковање, као што су Gigapack® (Stratagene) i Packagene® (Promega). Трансформација је знатно ефикаснија у поређењу са трансформацијом плазмидима λ фаг се, осим као вектор, користи и као извор низа других елемената и алата за генетичко инжињерство. Сos места и протеини главе и репа се комбинују са другим векторима при конструкцији хибридних вектора. Посебно се користе и ензими кодирани λ фагом, као λ егзонуклеаза.

39 Бактериофаг М13 Филаментозни фаг, не доводи до лизе ћелије. Има 11 гена (pI - pXI) Користи се за прављење ss копија DNA, матрица за место-специфичну мутагенезу, секвенцирање, специфичних проба, у нанотехнологији и др. pVII+pIX pVIII pIII pVI pV 8 1 - Везивање фага за F-пилус 2 – инфекција 3 - репликација θ-структуром 4 - транскрипција виралних гена 5 - репликација типа котрљајућег обруча и исецање нових једноланчаних генома 6 – циркуларизација 7 - ssDNA/pV комплекс 8 - паковање и излазак из ћелије. 1 F1 Спољна мем. Унутрашња мем. ? 7 2 4 5 Касна фаза (конц. pV висока) 3 + - +ssDNA потомство pII, pX pII, pX +ssDNA θ реплик. 6 Рана фаза (конц. pV ниска)

40 Хибридни вектори Козмиди (cosmids) су плазмиди са cos местима λ фага. Као и плазмиди, имају ORI, MCS и селектабилни маркер. Козмиди се у бактерији размножавају као велики плазмиди, јер немају гене за литички циклус, али се због cos места могу спаковати in vitro у вирусне честице, што олакшава трансформацију. Величина је до 50 Kbp, а капацитет је Kbp Фозмиди (fosmids) су слични козмидима и имају cos места, али су базирани на F-плазмиду. Капацитет фозмида је као и код козмида око 45 Kbp, а величине су до 50 Kbp.Као и F-плазмид, одржавају само једну копију по ћелији. Фагемиди или фазмиди (phagemids, phasmids) представљају комбинацију између филаментозног фага (М13 или f1) и плазмида. Ови вектори имају један плазмидни ORI, обично типа ColE1, да би могли да се разможавају у виду дволанчане ДНК као плазмиди, али и интергенски регион из f1 или М13 (f1 ORI), који омогућава умножавање у форми једноланчане ДНК и потом паковање у вирусне честице.

41 BAC – Bacterial Artificial Chromosomes
Примају у просеку 120 kB, али може до 300 kB САТ- селектабилни маркер-резистенција на хлорамфеникол oriS, repE, IncC – компоненте репликона из F-фактора – стриктна контрола броја копија parA, parB, parC – гени за партицију из F фактора који омогућавају правилну поделу после репликације између ћерки ћелија OriV – индуцибилни Ori, да се по потеби повећа бр. копија LacZа –за преглед путем -комплементације MCS loxP i cos – олакшавају вађење клониране секвенце

42 YAC – Yeast Artificial Chromosomes Трансформација квасца
Дигестија са BamHI + EcoRI Лева рука Десна рука EcoRI (непотпуна дигестија) Геномска ДНК фрагменти 400 Kbp- 1 Mbp Лигација Трансформација квасца

43 Трансформација Трансформација у ширем смислу подразумева сваки процес уноса стране ДНК у ћелије домаћина, било у форми линеарног (рекомбинантног) фрагмента или фрагмена убаченог у вектор, при чему долази до инкорпорације стране ДНК у геном и експресије страног генетичког материјала. У ужем смислу трансформација не укључује унос стране ДНК путем вируса или бактериофага, већ се овај процес назива трансдукција. Коњугација – размена ДНК ћелијским контактом (нпр. путем F-плазмида) Нуклеинске киселине не могу да уђу у бактеријске или еукариотске ћелије саме од себе, већ им је за пролазак кроз спољашњу мембрану или ћелијски зид и плазмамембрану потребна одговарајућа помоћ.

44 Методе трансформације
Биолошки или природни механизми Унос гена у бактерије помоћу бактериофагних вектора Унос гена у еукариотске ћелије вирусима (трансдукција) Унос гена у биљне ћелије посредством A. tumefaciens и A. rhizogenes Хемијски методи Трансформација бактерија плазмидима (CaCl2/топлотни шок метод) Трансформација протопласта огољеном ДНК (CaCl2/PEG метод) Физички методи Електропорација Биолистичка трансформација Трансформација силикон-карбидним влакнима Микроињектирање

45 Agrobacterium tumefaciens – животни циклус
A.t. је земљишна бактерија која код дикотила узрокује туморе crown gall Једини познат пример природног трансфера ДНК имеђу 2 царства A.t себи стварају посебну еколошку нишу тиме што терају биљку да производи ОПИНЕ – супстанце које само A.t може да користи

46 Ti плазмид T-DNA (transferred DNA) садржи: Граничнике LB i RB Cyt– синтеза цитокинина Aux– синтеза ауксина nos – за синтезу нопалина (или ocs – за октопин) Ostatak Ti plazmida sadrži: O – overdrive (enhancer) ORI noc катаболизам нопалина (или occ – катаболизам октопина) Tra – за трансфер плазмида коњугацијом Inc – за инкомпатибилност (имунитет на друге плазмиде) Vir region – geni za transfer T-DNA Т-DNA α-кетоглутарат аргинин пируват аргинин маноза глутамин нопалин октопин манопин ОПИНИ су храна за бактерију, извор N и C, које производи биљка. Најпознатији су НОПАЛИН, ОКТОПИН, МАНОПИН и АГРОПИН. α-KG+Arg Pyr+Arg

47 Трансфер Ti 1а Биљни геном Ацетосирингон chvE Тумор А А А А
Бактеријски хромозом 1б chvE Р Р 2 Синтеза ауксина цитокинина опина attR Р G 8 G chvB 7 pscA Катаболизам опина chvA E2 Р D2 E3 Vip1 F 9 ssT-DNA 5’ Р D2 D1 K-α LB RB C1 4 O E2 E2 E2 E2 E2 K-α K-α Ti плазмид 5 6 E3 E3 F Vip1 Vip1 Vip1 E2 Р D2 Р Vir D2 K-α 3 1в E3 Vip1 Vip1 Vip1 Vip1 E3 G Р E2 E2 E2 E2 E2 K-α Биљна ћелија B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B10 B11 D4 NTP S цитосол м п.п с.м. споља T-pilus - Vir протеини - Биљни протеини - Фосфатна група - Опини - Геномска ДНК - Т-ДНК LB- леви граничник RB – десни граничник O - енхенсер м - плазмамембрана п.п.- периплазматични простор с.м. – спољашња мембрана Р A. tumefaciens

48 Систем бинарних вектора
Страни ген и/или репортер Разоружан (помоћни) Ti плазмид Бинарни вектор (Вештачки Ti плазмид за трансформацију) E. coli A. tumefaciens биљна ћелија

49 Agrobacterium rhizogenes
Слична A. t., али има Ri (root inducing) плазмид Индукује туморе у виду длакавих коренова (hairy roots) који моду да расту и независно, у култури без хормона Из hairy roots се могу регенерисати целе трансгене биљке Примене A. rhizogenes, култура трансформисаних коренова и регенераната : Продукција секундарних метаболита Продукција терапеутских протеина Проучавање метаболичких путева и одговора биљака на хемикалије Експериментални систем за проучавање интеракција са другим организмима, као што су нематоде, микоризалне гљивице и патогени коренова. Фиторемедијација (акумулација тешких метала) Добијање трансгених биљака регенерацијом из културе коренова

50 Хемијска трансформација
Хемијска трансформација бактерија плазмидима – ћелије могу да постану КОМПЕТЕНТНЕ хлађењем у присуству двовалентних катјона, после чега бактеријски зид постаје пропустљив за плазмидну ДНК. После тога топлотни шок омогућава улазак ДНК у ћелију Ресуспензија бактеријског талога у раствору CaCl2 Чување компетентних ћелија на -80оС центрифу- гирање Аликвотирање компетентних ћелија Хлађење на леду Култура E. coli у log фази R Плазмид са геном за резистенцију на антибиотик Засејавање на подлози са антибиотиком 37оС Топлотни шок колонија/μг ДНК 42оС Водено купатило лед Хемијска трансформација биљних протопласта. Протопласти се могу учинити компетентним за трансформацију огољеном ДНК третманом полиетилен гликолом у присуству двовалентних катјона - обично Ca²+.

51 Електропорација + - R За бактерије, квасце и биљне протопласте
Електрично поље повећава пермеабилност мембране и може да направи привремене поре Важно је подесити параметре (V, t, фреквенцију) да се ћелије не оштете и не убију. 10 х ефективније од хемијског метода Поновити центрифугирање и ресуспендовање Ресуспензија бактеријског талога у стерилној води центрифу- гирање Компетентне ћелије Хлађење на леду Култура E. coli у log фази R Плазмид са геном за резистенцију на антибиотик Засејавање на подлози са антибиотиком колонија/μг ДНК Пуфер Електрошок лед

52 Биолистичка трансформација (gene gun, particle bombardment)
Користе се честице од злата или волфрама обложене са ДНК Примарно се користи за монокотиле пиштољ Цилиндар за акцелерацију гаса (Не) Прекидач вакуум/ вентилација/ пауза Окидач Мерач притиска гаса Главни прекидач Диск за пропуштање гаса (rupture disk) Зауставни екран Макроносач Микроносачи обложени са ДНК Зауставни екран Мерач вакуума

53 Селекција Трансформацијом се нови гени уносе у само мали број ћелија, па је следећи корак у генетичком инжењерству селекција трансформисаних ћелија међу нетрансформисаним. Селектабилни маркери су гени који се уводе у бактеријске или биљне ћелије паралелно са геном од интереса, на истом вектору, па се користе за селекцију трансформисаних организама и/или за праћење генске експресије Заједничка карактеристика селектабилних маркера и репортер гена је да се њихова експресија може лако пратити.

54 Типови селектабилних маркера
Селектабилни маркери за негативну селекцију су гени који успостављају резистенцију на антибиотике или хербициде. Ово је традиционални тип вештачке селекције који се означава као негативна селекција јер селектабилни агенс убија нетрансформисане ћелије. Селектабилни маркери за позитивну селекцију су гени који трансформантима омогућавају раст користећи супстанцу која је селектабилни агенс (нпр. алтернативни извор угљеника), али селектабилни агенс не убија нетрансформисане ћелије. Маркери за визуелну селекцију омогућавају визуелно разликовање трансформисаних и нетрансформисаних колонија или клонова, нпр. према боји или морфологији, при чему селективни притисак не постоји. Ови гени и нису селектабилни макери у стриктном смислу те речи, па их је правилније означавати прегледним маркерима или маркерима за сортирање (screenable markers). Репортер гени су посебан тип маркера за визуелну селекцију чија се експресија може квантификовати (scoreable markers).

55 Негативна селекција – резистенција
Резистенција на: Антибиотике Хербициде Токсине Антиметабилите Природни извор гена за резистенцију на антибиотике су бактеријски плазмиди и транспозони. Поједини антибиотици су специфични само за прокариоте или, рецимо, само за Грам-негативне бактерије, док су други токсични и за прокариоте и за еукариоте. Већина антибиотика инхибира синтезу протеина Гени за резистенцију већином кодирају за ензиме који модификују антибиотике нпр. фосфорилацијом или ацетилацијом и тако их детоксификују, али има и случајева када се резистенција заснива на избацивању антибиотика из ћелије. Ген за резистенцију се убацује заједно са геном од интереса у бактерију или биљну ћелију и остаје у потомству (страх у јавности од ГМО, да се резистенција не прошири на друге организме)

56 Резистенција на антибиотике
NPT Хлорамфеникол Канамицин ATP ADP CАТ CH3COSCoA HSCoA Ампицилин (R=NH2) Карбеницилин (R=COOH) Тетрациклин H+ TET BLA

57 Маркери за позитивну селекцију
Маркери за позитивну селекцију су нова генерација маркера који се користе уместо гена за резистенцију. Трансформисане ћелије добијају способност да метаболишу супстрате које раније нису могле да користе, па зато брже расту, а нетрансформисане споро или никако. Селектабилни агенс НЕ УБИЈА нетрансформисане ћелије Ензими који преводе неактиван биљни хормон у активну форму Ензими који омогућавају коришћење алтернативних угљених хидрата, необичних шећера и сл. Фосфоманозо изомераза (PMI), пореклом из E. сoli, катализује интерконверзију манозо-6-P у фруктозо-6-P. Само трансформисане биљке са PMI могу да живе на медијуму са манозом и користе је као извор С.

58 Маркери за визуелну селекцију
Маркери за визуелну селекцију (screening) омогућавају да се трансформисани и нетрансформисани организми разликују, нпр. по боји или по морфологији, али сви преживљавају. Најпознатији тип визуелне селекције, α-комплементација (blue-white screen) је базиран на лактозном оперону LacI P LacY LacZ LacA cap O T Промотор и оператор Промотор Регулатор Место за САР протеин R β-Галактозидаза Пермеаза Транс-ацетилаза Терми-натор Репресор Алолактоза Лактоза Галактоза + глукоза Лактозни оперон

59 b + Физиолошка реакција Природни индуктор Вештачки индуктор Бојена
Н2О b + Лактоза (галактоза-(b14)-глукоза) D-галактоза D-глукоза Природни индуктор Алолактоза (галактоза-(b16)-глукоза) Вештачки индуктор IPTG (изопропил-b-D-тиогалактозид) b-гал Н2О D-гал. окси- дација Бојена реакција Индиго плаво (5,5’-дибромо-4,4’-дихлоро-1Н,1’Н- (2,2’)бииндолилдиен-3,3’-дион) 5-бромо-4-хлоро- 3-хидроксииндол X-gal (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-b-D-галактозид) b-гал Н2О D-гал. Бојена реакција О-нитрофенол (жуто) ONPG (O-нитрофенил-b-D-галактопиранозид)

60 α ω ω ω R P LacI cap P O LacZ 5’ 3’ LacY LacA T R R 5’ 3’ 3’ 3’
Промотор Регулатор Место за САР протеин Промотор и оператор β-Галактозидаза Пермеаза Транс-ацетилаза Терми-натор R P LacI cap P O LacZ 5’ 3’ LacY LacA T ω-фрагмент (C-терминус) Репресор R α-фрагмент (N-терминус) IPTG R IPTG Нетрансформисана бактерија (бела, али не расте на ампицилину) Бактерија трансформисана “празним” вектором Бактерија трансформисана вектором са страним геном MCS X-gal 5’ ИНДИГО ГЕН плазмид плазмид amp α amp ω ω ω 3’ 3’ 3’ F’- плазмид Бактеријски хромозом без Lac оперона

61 Репортер гени Репортер гени су посебан тип маркера за визуелну селекцију чија се експресија може квантификовати (scoreable markers). Експресија репортера се лако прати (бојене реакције, флуоресценција) Репортери су физички повезани са ГОИ – на истом фрагменту ДНК, или у фузији са ГОИ

62 Генске фузије Генске фузије Одређивање ефикасности
система за трансформацију Само репортер P Репортер 3’UTR Репортер и ГОИ посебно P Репортер 3’UTR P ГОИ 3’UTR Селекција ATG STOP Транскрипциони репортер (промотор ГОИ) P Репортер 3’UTR Генске фузије ATG STOP P Репортер линкер ГОИ 3’UTR ATG STOP Праћење експресије, анализе промотора и др Транслациони репортери P ГОИ Репортер 3’UTR ATG STOP STOP P Репортер ГОИ 3’UTR

63 Најпознатији репортери
CAT – хлорамфеникол ацетилтрансфераза (застарело) β-galaktozidaza (IPTG индуцер и ONPG супстрат) β-glukuronidaza – разлаже разне глукурониде, користе се они који дају бојене реакције, као X-Gluc. Користи се само код биљака. Луцифераза ГФП

64 Green Fluorescent Protein (GFP)
GFP је мали протеин, 238 АА, 26.9 kDa са хромофором (exc 395 i 475 nm, em 508 nm) Изолован из медузе Aequorea victoria, али постоји и код др. Cnidaria Хромофора се формира спонтано циклизацијом и оксидацијом (Ser66-Tyr67-Glz68), заштићена централним α-хеликсом и спољашњим β-буренцетом.

65 Зашто је GFP одличан репортер?
1 полипептид Хромофора се прави спонтано Не затева коензиме ни кофакторе Јако стабилан Није токсичан GFP се користи као: Прегледни маркер Репортер, фузиони репортер Мерење експресије in vivo Праћење експресије у времену и простору Проучавање интраћелијског транспорта протеина Проучавање протеин-протеин интеракција (FRET) Обележавање једноћелијских организама, праћење ћелијски линија Идентификација лабораторијски организама и сојева који се пусте у природу