Molekulārās metodes mikrobioloģijā

Παρουσίαση με θέμα: "Molekulārās metodes mikrobioloģijā"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Molekulārās metodes mikrobioloģijā
Teorija 1. Genomiskās DNS izdalīšana 2016./2017. mācību gada 2. semestris Māris Lazdiņš LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

2 Lielmolekulāras DNS izdalīšana
1. Bioloģiskā materiāla iegūšana. 2. Audu dezintegrēšana - parasti mehāniska. 3. Šūnu noārdīšana (lizēšana) - mehāniska, ķīmiska. 4. DNS attīrīšana no citiem savienojumiem. 5. DNS izgulsnēšana un šķīdināšana. 6. DNS papildus attīrīšana. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

3 Cik daudz materiāla vajag ?
Vienā diploīdā cilvēka šūnā - 6,6 pg (6,6x10-12g) DNS Vienā E. coli šūnā - 5,0 fg (5,0x10-15g) DNS Lai iegūtu 50 mg DNS, vajadzētu: ~107 cilvēka šūnu (apmēram, ml asiņu) ~1010 E. coli šūnu (apmēram, 2 ml tipiskas E. coli naktskultūras, kas atbilst ~ 6 mg mitro nogulšņu) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

4 Cik daudz materiāla vajag ?
Reālais DNS iznākums parasti mazāks, piemēram: ~2 mg DNS no 1 g zīdītājdzīvnieku audiem, mg DNS no 1 g augu materiāla, mg DNS no 1 ml baktēriju kultūras ~20 mg DNS no 1 ml cilvēka asiņu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

5 Bioloģiskā materiāla iegūšana
Der jebkuras šūnas un audi, kuros atrodas DNS. - zīdītāju eritrocīti un trombocīti ir bez kodoliem. Jāraugās, lai materiāls būtu tīrs, bez citu organismu vai DNS piesārņojuma. No piesārņojuma jāuzmanās arī DNS izdalīšanas laikā, - reaģenti nedrīkst būtu piesārņoti ar mikroorganismiem vai citu DNS. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

6 Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

7 Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.
Blīvas daudzšūnu struktūras sadala pēc iespējas mazākos gabalos, lai uzlabotu lizējošo šķīdumu piekļuvi materiālam un palielinātu to iedarbības virsmu. Nav nepieciešama materiāliem atsevišķu šūnu formā: - baktēriju, raugu kultūras, - eikariotu šūnu kultūras, - asinis, - sperma, amniocīti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

8 Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.
Strādājot ar audiem, - īpaši ar augu materiālu, homogenizācija ir nepieciešama. Izmanto - gaļas mašīnas, - dzirnavas; LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

9 Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.
Sasaldē un homogenizē - piestā, - speciālos vibrohomogenizātoros, - koloidālajās lodīšu dzirnavās. Var iesaldētus audus homogenizēt ar āmuru. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

10 Audu homogenizēšana vai dezintegrēšana.
Daži materiālu veidi viegli sagraujami beržot piestā. Materiālu parasti iesaldē ar šķidru slāpekli un saberž smalkā pulverī. Efektivitāti palielina pievienotas: - kvarca smiltis, - stikla pulveris, - alumīnija oksīda pulveris. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

11 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Nažu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar rotējošiem nažiem. Lieto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

12 Dounča homogenizators.
(Dounce homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

13 Potera homogenizators.
(Potter [Elvehjem ] homogenizer) Materiāls tiek saberzts starp cilindru un virzuli. Lieto mīksto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

14 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Lodīšu dzirnavas. Materiāls tiek samalts ar lodītēm vibrējošā kapsulā. Materiālu parasti iesaldē. Lieto audu gabalu homogenizēšani. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

15 Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).
Straujās svārstības vidē veiksmīgi iedarbojas uz šūnām un audu gabaliņiem, radot spēcīgu nobīdes deformāciju. Jāuzmanās no pārmērīgas parauga sasilšanas un putošanās - veic ledus vannā. Šūnu un audu suspensijā, notiek arī DNS fragmentācija. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

16 Ultraskaņas dezintegrēšana (sonikācija).
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

17 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Frenča presse. (French Press ) Šūnas ar lielu spiedienu tiek dzītas cauri ļoti smalkai sprauslai. Pielieto mikroorganismiem ar šūnapvalku (baktērijas, aļģes, raugi) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

18 Homogenizēšana ar stikla daļiņām.
Materiālu vorteksē kopā ar stikla daļiņām. Lieto audu kultūru, baktēriju suspensijām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

19 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

20 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas buferos parasti ietver: Tris - HCl mM pH 6,5 - 8,0 Savienojums bufersistēmu veidošanai, lai uzturētu noteiktu pH. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

21 Tris-bāze LD50 / orāli / žurkai = 5 900 mg/kg kairina ādu, gļotādas Xi
2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Tris(hidroksimetil)aminometāns; Trometamīns; Trizma u.c. C4H11NO3 (HOCH2)3CNH2 LD50 / orāli / žurkai = mg/kg kairina ādu, gļotādas Xi Sintētiska viela (~1940) ar bāziskām īpašībām (pH ~ 10,5) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

22 Tris-bāze Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955)
H+ 2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Plaši izmanto bufersistēmu pagatavošanai, (1955) pH 6,5 - 8,5 titrējot ar dažādām skābēm, visbiežāk HCl => Tris - HCl Bieži lietotās pH vērtības: 6, , , ,0 Gatavo 2M izejas šķīdumu ar vajadzīgo pH LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

23 Tris-bāze Elektroforēzei bieži izmanto: Tris - borāta (borskābe)
2-Amino-2-(hidroksimetil)- -1,3-propāndiols Elektroforēzei bieži izmanto: Tris - borāta (borskābe) Tris - acetāta (etiķskābe) Tris - glicīna Tris - alanīna (aminoskābes) bufersistēmas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

24 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas buferos tāpat kā daudzos citos šķīdumos darbam ar nukleīnskābēm parasti ietver: EDTA mM koncentrācijā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

25 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
EDTA EDTA - Etilēndiamīn-N,N,N',N'-tetraetiķskābe Etilendiamīn- tetraetiķskābe C10H16N2O8 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

26 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
EDTA Etilendiamīn- tetraetiķskābe LD50 / orāli / žurkai = mg/kg Sintētiska viela (~1935) ar maz izteiktām skābes īpašībām. EDTA skābes formai maza šķīdība ūdenī (~0,5g/l), tādēļ parasti lieto tās sāļus ar vienvērtīgajiem katjoniem. Visbiežāk izmanto dinātrija sāli (Na2EDTA), kura ūdenī šķīst daudz labāk. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

27 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
EDTA EDTA Savienojums labi saista divvērtīgo metālu jonus (Ca++, Mg++), kuri nepieciešami nukleāžu un citu hidrolītisko enzīmu aktivitātei. Pievieno arī asins paraugiem uzglabāšanas laikā kā pretrecēšanas līdzekli, jo tas saista asins recēšanai nepieciešamos Ca++ jonus (EDTA vakutaineri). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

28 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
EDTA Laboratorijas vajadzībām gatavo 0,5M izejas šķīdumu. Lai viela pilnībā izšķīstu, ar NaOH šķīdumu titrē līdz pH 8,0 Darba šķīdumos EDTA koncentrācija parasti mM LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

29 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
EDTA Plašāks pielietojums - kā ūdens mīkstinātājs un dažādu daudzvērtīgo metālu jonu helators rūpnieciskajos un ūdens attīrīšanas procesos; EDTA sāļi arī kā pārtikas piede- va - stabilizators (E385; E386); Medicīnā kā pretinde saindējo- ties ar smago metālu sāļiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

30 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas vai ķīmiskās noārdīšanas procesu pamatā veic ar jonisko deterģentu palīdzību. Bieži tiek izmantots ~ 0,5% SDS (beigu koncentrācija darba šķīdumā). ! ! ! Pievieno, kad šūnas labi izjauktas lizēšanas buferī. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

31 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
SDS Nātrija dodecilsulfāts NaC12H25SO4 Nātrija laurilsulfāts SLS (sadzīves ķīmijā) LD50 / orāli / žurkai = mg/kg kairina ādu, gļotādas Xi LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

32 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
SDS Pussintētiska viela, ko pamatā iegūst no eļļas palmu augļu un kokosriekstu eļļas (bagātas ar laurilskābi). Ūdens šķīdumiem bāziskas īpašības (pH 9-10). SDS Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloidālas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

33 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
SDS Pielietojums: - Audu un šūnu ķīmiska noārdīšana (P., nukleīnskābju izdalīšana), - Proteīnu denaturēšana gelelektroforēzē, (~1 SDS molekula uz 2 aminoskābju atlikumiem) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

34 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
SDS SDS Gatavo 10% izejas šķīdumu ūdenī. Uzglabā istabas temperatūrā, lai SDS nekristalizētos un šķīdums "nesasaltu". SDS kā deterģents plaši tiek lietots arī sadzīves ķīmijā: - šampūni, - tehniskie mazgāšanas līdzekļi, - šķidrās ziepes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

35 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas gaitā nereti tiek izmantota materiāla apstrāde ar : Proteināzi K Proteolītisks enzīms. Aktivitāti iespējams divkāršot paaugstinot temperatūru no 37°C => 50° - 60°C virs 65°C sākas strauja enzīma denaturācija. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

36 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Proteināze K Optimālais pH: Aktivitātei netraucē denaturējoši aģenti: - SDS 0,5 - 1,0 %, - urīnviela M. EC LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

37 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Proteināzes K Aktivitātei netraucē : - jonu helatori (EDTA) (enzīmam vēlami Ca+ joni, bet tā stabilitātei, ne aktivitātei); - tripsīna un himotripsīna inhibitori. Enzīmu iespējams izmantot apstākļos, kad vairums šūnas enzīmu (nukleāžu) zaudējuši aktivitāti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

38 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Proteināzi K iegūst no sēnes Tritirachium album līnijas Limber. Endoproteāze. Serīna proteāze. EC Peptīdsaiti šķeļ karboksil grupas pusē no alifātiskajām, aromātiskajām vai hidrofobajām aminoskābēm. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

39 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Proteināzi K Parasti izmantotā beigu koncentrācija darba šķīdumos: 0,05 - 1,0 mg/ml Izejas šķīdumu koncentrācija 20 mg/ml vai 10 mg/ml, Šķīdina ūdenī vai uzglabāšanas buferī: 20mM Tris-HCl (pH 7.4), 1mM CaCl2 50 % glicerols Fasē un uzglabā mazos tilpumos - 20o C LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

40 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Proteināze K tiek izmantota arī šūnu struktūru noārdīšanai, lai labāk izdalītu to sastāvdaļas, piemēram, mitohondrijus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

41 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Apstrādi ar Proteināzi K var papildināt vai aizstāt ar joniskā deterģenta CTAB klātbūtni. Tas ne tikai denaturē proteīnus, bet arī ar tā palīdzību iespējams izgulsnēt nukleīnskābes. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

42 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB Cetiltrimetilamonija bromīds (Heksadecil-trimetil-amonija bromīds) cetyltrimethylammonium bromide, hexadecyltrimethylammonium bromide, CTAB C19H42BrN Spēcīgs joniskais deterģents, veido smalki koloīdas sistēmas ar ūdenī nešķīstošām un hidrofobām vielām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

43 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN LD50 / orāli / žurkai = 410 mg/kg kairina ādu, gļotādas, acis Xi Xn izteikti toksisks ūdenī dzīvojošiem organismiem Plaši izmanto arī kā antiseptisko līdzeklis pret baktērijām un sēnēm. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

44 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB Cetiltrimetilamonija bromīds C19H42BrN DNS salīdzinoši labi šķīst CTAB šķīdumos ar lielu sāļu koncentrāciju, šādos šķīdumos labi šķīst arī polifenoli un polisaharīdi. (parasti izmanto NaCl koncentrācijas > 0,8 M). Samazinot sāļu koncentrāciju, DNS šķīdība CTAB klātienē samazinās, taču polifenolu un polisaharīdu šķīdību tas praktiski neietekmē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

45 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB Samazinot sāļu koncentrāciju (NaCl konc. < 0,5 M), piemēram, pievienojot precipitācijas šķīdumu ar 40 mM NaCl koncentrāciju, DNS tiek izgulsnēta, bet daudzus enzīmus inhibējošie polisaharīdi un polifenoli paliek šķīdumā. DNS nogulsnes šķīdina lielas koncentrācijas (1,2 M) NaCl šķīdumā, atšķaidot izgulsnētās CTAB paliekas un novēršot savienojuma spējas izgulsnēt DNS, kad vēlāk sāļu koncentrācija atkal tiks samazināta. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

46 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB DNS izdalīšana ar CTAB palīdzību īpaši izdevīga apstrādājot augu valsts paraugus, kuriem raksturīgs liels polifenolu un polisaharīdu saturs. CTAB mazāk efektīvi izgulsnē RNS, tādēļ ar šo metodi iegūtajiem DNS paraugiem parasti ir mazāk RNS piemaisījumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

47 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
CTAB Dažkārt CTAB lizējošiem šķīdumiem papildus pievieno arī β-merkaptoetanolu un/vai polivinilpirolidonu, taču tas ievērojami saīsina pagatavoto šķīdumu derīguma laiku (derīgs 2-3 dienas). CTAB izmantošana DNS izdalīšanai tika ieviesta ~ gadā. Murray, M.G. and Thompson, W.F. (1980). Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Research 8, 4321–4325. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

48 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī: N-Lauroilsarkozīnu (sarkozilu), parasti tā nātrija sāls veidā Sodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl C15H29NO3 vai C15H28NNaO3 Lurilskābes un sarkozīna (N-metilglicīna) veidots amīds. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

49 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana N-Lauroilsarkozīns (sarkozils) vai tā nātrija sāls Sodium lauroyl sarcosinate, sarkosyl C15H29NO3 vai C15H28NNaO3 Aktīvs deterģents, ja tā koncentrācija lielāka par 1%, traucē proteināzes K darbību. Mazās koncentrācijās tiek izmantots arī kā transkripcijas iniciācijas inhibitors. Tiek izmantots dažādos mazgāšanas līdzekļos un šampūnos. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

50 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī: Guanidīna hlorīdu (Guanidīna hidrohlorīdu) Guanidinium chloride GuHCl CH6ClN3 Ļoti spēcīgs proteīnus denaturējošs aģents. "Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem (diatomaceous earth). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

51 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizēšanas buferī dažreiz lieto arī: Guanidīna tiocianātu Guanidinium thiocyanate GITC C2H6N4S Tāpat ļoti spēcīgs proteīnus denaturējošs aģents. "Haotropā" viela, kas veicina NS saistību ar silikātiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

52 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Baktēriju lizēšanai iesaka izmantot - lizocīmu (lysozyme; muramidase ) EC vai - stafolizīnu (stapholysin; lysostaphin ) - ahromopeptidāzi (achromopeptidase) u. c. enzīmus, kuri katalizē baktēriju šūnapvalkus veidojošo lielmolekulāro savienojumu hidrolīzi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

53 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC N-acetilglikozamīns N-acetilmuramskābe Veicina īsto baktēriju šūnapvalku sastāvā ietilpstošo peptidoglikānu (mureīnu) noārdīšanos, katalizējot hidrolīzi glikozīdiskajai saitei starp N-acetilmuramskābi un N-acetilglikozamīnu. (NAG) (NAM) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

54 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Lizocīms (lizozīms) (lysozyme; muramidase ) EC Dzīvnieku nespecifiskās imūnsistēmas sastāvdaļa, izdalās siekalās, pienā, sviedros, gremošanas traktā. Lielā daudzumā atrodams putnu olu baltumā, izmanto arī pārtikā kā konservantu E 1105 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

55 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Šūnu lizēšana Rauga šūnu hitīna apvalku noārdīšanu veicina citi enzīmi, piemēram, Zimoliāze (zymolyase) - EC , ko iegūst no baktērijām Arthrobacter luteus vai Gluzulāzi (glusulase) no vīngliemežu Helix pomatia zarnu ekstrakta, kas ir glikuronidāzes, glikuron-sulfatāzes un celulāzes maisījums u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

56 Organiskā ekstrakcija.
Lieto ar buferšķīdumu (ūdeni) piesātinātu fenolu; Fenola:hloroforma:izoamilspirta maisījumu; (25:24:1) Hloroformu. Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus, piemēram, hēma gredzenus u.c. Ūdens un organisko fāzi ņem tilpuma attiecībās 1:1 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

57 Organiskā ekstrakcija.
Tās visas ir vielas ar hidrofobām īpašībām, ar kurām var labi denaturēt proteīnus un ekstraģēt hidrofobus piemaisījumus. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

58 Organiskā ekstrakcija.
Vorteksējot izveido abu fāzu emulsiju, lai palielinātu fāzu saskares virsmu. Centrifugējot fāzes atdalās, starp tām paliek denaturētu piemaisījumu slānis (šūnapvalku polisaharīdi, proteīni u.c.). Ūdens fāze DNS atrodas ūdens fāzē, to atsūc un pārnes uz jaunu stobriņu. Denaturētie piemaisījumi Organiskā fāze LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

59 Organiskā ekstrakcija.
!!! Fenola reakcijai jābūt viegli sārmainai vai neitrālai. Ja reakcija ir skāba, DNS sāk šķīst organiskajā fāzē, kā rezultātā var rasties lieli DNS zudumi. Fenolam ir tendence oksidēties par benzoskābi, kura paskābina organisko fāzi. Vēlams fenolu līdzsvarot ar nedaudz sārmainu Tris buferšķīdumu un pievienot kādu antioksidantu (piemēram, oksihinolīnu.) LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

60 Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana. Pārdestilētu fenolu izkausē oC ūdens vannā. Pievieno tādu pašu tilpumu 1M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min). Šajā procesā organiskās fāzes tilpums palielināsies. Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot. Novāc ūdens/buferšķīduma fāzi. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

61 Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana. Pievieno tādu pašu tilpumu 0,1 M Tris-Cl pH 8,0 un abas fāzes sajauc, maisot uz magnētiskā maisītāja (~15 min). Ļauj fāzēm atdalīties maisījumu nostādinot. Pārbauda ūdens fāzes pH. Ja pH < 8,0 atkārto fenola līdzsvarošanu ar 1M Tris-Cl pH 8,0. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

62 Organiskā ekstrakcija.
Fenola sagatavošana. Kad buferšķīduma pH vairs nav būtiski samazinājies, pievieno oksihinolīnu (tā beigu koncentrācija organiskajā fāzē 0,1%) un, ja nepieciešams, vēl citus komponentus (hloroformu, izoamilspirtu). Iegūto maisījumu uzglabā zem 0,1 M (vai citas koncentrācijas) Tris-Cl pH 8,0. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

63 Organiskā ekstrakcija.
Hloroformu izmanto: lai denaturētu proteīnus un ekstraģētu hidrofobus savienojumus; maisījumā ar fenolu, arī lai palielinātu organiskās fāzes blīvumu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

64 Organiskā ekstrakcija.
Izoamilspirtu izmanto: lai palielinātu organiskā maisījuma virsmas spraigumu, kas novērš: - putošanos apstrādes gaitā; - uzlabo ūdens un organiskās fāzes atdalīšanas iespējas. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

65 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana Lai atbrīvotos no dažādiem: - neorganiskiem sāļiem, - deterģentiem, - fenola/hloroforma paliekām, - mazmolekulārajiem org. savienojumiem; un palielinātu DNS koncentrāciju, veic DNS izgulsnēšanu no šķīduma. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

66 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana Izmanto lielmolekulāro NS īpatnību - to šķīdība jūtami samazinās % spirtu šķīdumos, īpaši monovalento katjonu (Na+, K+, Li+) klātbūtnē. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

67 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana Li+ jonu klātbūtnē labāk izgulsnējas RNS molekulas. Šo īpašību dažās metodēs izmanto, lai DNS paraugus atbrīvotu no lieliem RNS piemaisījumiem. Izgulsnēšanai lieto 96o vai 100o etanolu tilpuma attiecībās 2:1 vai (pirmais skaitlis - spirta tilpums) Izopropanolu tilpuma attiecībās 0,6:1 - 1:1 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

68 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana Var arī izgulsnēt tikai ar lielām ( virs 1M) monovalento katjonu (Na+, K+, Li+) koncentrācijām, visbiežāk lieto NaCl. taču šajā gadījumā grūtāk DNS atbrīvot no sāļu paliekām. NaCl un LiCl parasti sagatavot 5M izejas šķīdumu veidā. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

69 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana DNS efektīvāk izgulsnējas no koncentrētiem DNS šķīdumiem, kuros DNS pavedieni viegli sastop viens otru, saķeras kopā un veido lielus precipitātus. Optimālā gadījumā visa genomiskā DNS saķeras vienā lielā kamolā, kuru var izcelt no šķīduma ar stikla āķīti vai piesūcot pipetes uzgalim. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

70 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS izgulsnēšana Lai DNS veiksmīgi izgulsnētu no ļoti atšķaidītiem šķīdumiem, dažkārt papildus pievieno: - attīrītu RNS, - glikogēnu u.c. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

71 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS savākšana Ja veidojas daudzi sīki DNS precipitātu fragmenti vai tos vispār nevar saskatīt, paraugs jācentrifugē. Bieži pēc genomiskās DNS sablīvēšanas, īpaši ja DNS ir daudz, rodas problēmas ar tās izšķīdināšanu. Labi izšķīst tikai īsie DNS fragmenti. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

72 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS attīrīšana Lai atbrīvotos no palikušām - neorganisko sāļu, - izopropanola, - fenola paliekām, veic DNS nogulšņu mazgāšanu ar 700 (800) etanolu. Šādā etanola koncentrācijā DNS nešķīst, bet neorganiskie sāļi un citi mazmolekulārie savienojumi daļēji saglabā šķīdību. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

73 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS attīrīšana DNS pārnes stobriņā ar 700 (70%) etanolu, maisa invertējot (vai vorteksējot), pārnes uz nākošo stobriņu. Pēc tam atsūc etanola paliekas, var nedaudz pažāvēt (10-15 min.) telpas apstākļos. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

74 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS attīrīšana Sablīvētu, kārtīgi izkaltētu genomisko DNS vairs nevar izšķīdināt pat vārot !!! DNS šķīdina dest. ūdenī vai TE buferī. TE 10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 mM EDTA LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

75 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS šķīdināšana DNS šķīšanas ātrums atkarīgs no fragmentu garuma, sablīvētības pakāpes un lielmolekulāru piemaisījumu daudzuma. Pareizi izdalīta genomiskā DNS pilnībā izšķīst tikai pēc stundām. Genomiskās DNS šķīdumu iesaka glabāt 4oC LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

76 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS uzglabāšana Iesaldēšana un atkausēšana rada DNS fragmentāciju. Izdalīto DNS var fasēt mazos tilpumos, lai novērstu atkārtotu iesaldēšanu un atkausēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

77 DNS papildus attīrīšana
Ja grib atbrīvoties no RNS piemaisījumiem DNS preparātā, to var darīt ar RN-āžu (ribonukleāžu) palīdzību. No RN-āzes savukārt atbrīvojas ar atkārtotu fenola (hloroforma) ekstrakciju un DNS pārgulsnēšanu. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

78 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Ribonukleāzes - enzīmi, kas katalizē RNS molekulu hidrolīzi. Dažas RN-āzes katalizē RNS molekulas hidrolīzi pēc noteikta nukleotīda un tiek lietotas aptuvenas RNS nukleotīdu secības noteikšanai, tomēr vairumam enzīmu katalizētā hidrolīze ir nespecifiska vai vairāk saistīta ar RNS telpiskajām struktūrām. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

79 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Ribonukleāzes RNāze A (pankreātiskā) EC Iegūst no liellopu aizkuņģa dziedzera. Endoribonukleāze, kas pazīst pirimidīna nukleotīdus un šķeļot veido fragmentus ar fosfātgrupu 3' galā un hidroksilgrupu 5' galā. Izmanto DNS preparātu atbrīvošanai no RNS piemaisījumiem. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

80 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Ribonukleāzes RNāze A Vēlams lietot molekulārās bioloģijas tīrības klases enzīmu, kurš speciāli attīrīts no DN-āzēm un svešas DNS piemaisījumiem. RN-āze A ir termo izturīga, šo īpašību izmanto, lai to atbrīvotu no, parasti, termo nestabilajām DN-āzēm. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

81 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
Ribonukleāzes RNāze A Izejas šķīdumu gatavo ūdunī vai TE buferī ar koncentrāciju 10 vai 1 mg/ml. Pēc izšķīdināšanas min. tur vārošā ūdens vannā. Fasē nelielos tilpumos un glabā -20oC. Darba šķīdumos parasti lieto koncentrācijas µg/ml. LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

82 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
DNS attīrīšana Papildus attīrīšanai var lietot jonapmaiņas vai gelfiltrācijas hromatogrāfijas kolonnas. Var lietot ultracentrifugāciju CsCl2 gradientā vai pārgulsnēšanu ar PEG (polietilēnglikolu). LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

83 LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML
LU Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML