Μοριακοί δείκτες στην αρχαιολογία και παλαιοντολογία

Παρουσίαση με θέμα: "Μοριακοί δείκτες στην αρχαιολογία και παλαιοντολογία"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Μοριακοί δείκτες στην αρχαιολογία και παλαιοντολογία

2 Επανάκτηση και ανάλυση παλαιού ή αρχαίου DNA: μοριακή αρχαιολογία / ανθρωπολογία
Γιατί να μελετήσουμε αρχαίο DNA (aDNA)? Πώς απομονώνουμε aDNA Παλιές μελέτες aDNA Οδηγίες για μελέτη aDNA Ξαναφτιάχνοντας εξαφανισμένες αλληλουχίες

3 Τι είναι aDNA και γιατί είναι ενδιαφέρον?
Αποκάλυψη του μυστηρίου των εξαφανίσεων Μείωση ποικιλομορφίας ή εξαφάνιση ωφέλιμων αλληλομόρφων; Εξάπλωση παθογόνων ή αύξηση επιβλαβών αλληλομόρφων; Εξιχνίαση ειδογένεσης στο μοριακό επίπεδο Μεγάλο ενδιαφέρον στην ανθρώπινη εξέλιξη/ειδογένεση Το aDNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να καθορίσει ζωικές δίαιτες

4 Αλληλουχίες DNA από εξαφανισμένα είδη ζώων

5 Τι συμβαίνει στο DNA μετά θάνατον?
Συνήθως, γρήγορη φθορά: νουκλεάσες, μικροβιακή αποσύνθεση Σπανιότερα το DNA μπορεί να αποφύγει την αποσύνθεση λόγω: Γρήγορης αφυδάτωσης Χαμηλών θερμοκρασιών Υψηλής αλατότητας Αργή φθορά: Αποπουρίνωση (απώλεια A και G βάσεων) Οξείδωση Υδρόλυση

6 Θέσεις στο DNA που προσβάλλονται από μακροχρόνιες χημικές διεργασίες

7 Η μεταλλαξιγόνος δράση της θερμότητας

8 Η επίδραση της καταστροφής του DNA
Μετατροπή (οξείδωση) των καταλοίπων C και T σε υδαντοΐνες, που αναστέλλουν τις DNA πολυμεράσες (PCR) Απαμίνωση των C έχει σαν αποτέλεσμα την είσοδο λανθασμένης βάσης κατά την PCR--ψευδείς μεταλλάξεις (Pairs with C)

9 Όσο πιο αρχαίο, τόσο πιο αποικοδομημένο, τόσο λιγότερο χρήσιμο
100,000 με 1,000,000 χρόνια θεωρείται το όριο που το DNA μπορεί να δώσει χρήσιμες αλληλουχίες

10 SB Carroll (2003) Nature 422 p. 849

11 Οι πρώτες απομονώσεις αρχαίου DNA
Κλωνοποίηση DNA από Quagga (εξαφανισμένος συγγενής της ζέβρας) από μουσειακό δείγμα (Higuchi et al. 1984) Κλωνοποίηση DNA από μούμια 2430 ετών (Paabo 1985) 1) Απομόνωση DNA (20 micrograms/gram mummy tissue) 2) Επεξεργασία με Klenow (DNA polymerase) για τη δημιουργία DNA τμημάτων με τυφλά άκρα 3) Κλωνοποίηση σε προ-επεξεργασμένο με αλκαλική φωσφατάση pUC8 (pMUM plasmids) ***Η κλωνοποίηση, όμως, έχει τα προβλήματά της, πχ επιδιόρθωση του DNA μετά το μετασχηματισμό (> ψευδείς μεταλλάξεις)

12 Η επανάσταση στην απομόνωση αρχαίου DNA: PCR
PCR--κερδίζεις πολλά από λίγα, απευθείας αλληλούχιση PCR προϊόντων Επιτρέπει στοχευμένες μελέτες συγκεκρι-μένων γονιδίων ή περιοχών του DNA Το μιτοχονδριακό DNA είναι ο κλασικός στόχος μελετών aDNA με PCR Ο αριθμός αντιγράφων των μιτοχονδρίων είναι σχετικά ψηλός σε σύγκριση με το πυρηνικό DNA

13 Προσδιορίζοντας αρχαία υπολείμματα που είναι πιθανό να δώσουν καλής ποιότητας PCR
Ρακεμοποίηση των αμινοξέων: η μετατροπή των L-αμινοξέων σε D-αμινοξέα Ο ρυθμός εξαρτάται από το νερό, τη θερμοκρασία, χηλικά μεταλλικά ιόντα (καταστάσεις που επηρεάζουν επίσης και το ρυθμό της απο-πουρίνωσης του DNA) Όσο ψηλότερος ο λόγος D/L, τόσο δυσκολότερη η απομόνωση DNA: >0.08, δεν είναι δυνατή η απομόνωση DNA Ο υπολογισμός του λόγου D/L είναι εύκολος και γρήγορος

14 Προφυλάξεις για την PCR αρχαίου DNA (ιδιαίτερα από ανθρώπινα υπολείμματα)
Βιοχημικές δοκιμές για την κατάσταση του δείγματος Αναλογία L/D αμινοξέα Αντιδράσεις ελέγχου και κοντρόλ PCR Αντίστροφη σχέση ανάμεσα στο μέγεθος του ενισχυόμενου DNA και της απόδοσης της PCR Ποσοτικοποίηση του προς ενίσχυση DNA Αν ο αριθμός των μορίων DNA για την PCR είναι μικρότερος του 1000, απαιτούνται τουλάχιστον 3 ανεξάρτητες αντιδράσεις ενίσχυσης, τα προϊόντα πρέπει να κλωνοποιηθούν και αρκετοί κλώνοι πρέπει να αλληλουχηθούν Ενίσχυση από δεύτερη, ξεχωριστή απομόνωση γενετικού υλικού Αναπαραγωγή σε δεύτερο εργαστήριο

15

16 Απολιθωμένα κόπρανα: πλούσια πηγή πληροφοριών
Για την απομόνωση DNA ικανού προς PCR ενίσχυση: κατεργασία με αντιδραστήρια που διασπούν πολυμερισμένα σάκχαρα

17 Δύο DNA μελέτες απολιθωμένων κοπράνων
Από απολιθωμένα κόπρανα των ground sloths (βραδύποδες εδάφους): κωνοφόρα δάση υπήρχαν στη νότια Νεβάδα πριν από 28,500 χρόνια, αλλά εξαφανίστηκαν περίπου πριν από 20,000 χρόνια Ανάλυση της δίαιτας αρχαίων ανθρώπων: σε μια μελέτη βρέθηκαν μιτοχονδριακές αλληλουχίες από 8 διαφορετικά φυτά και από κρέας πολλών τύπων μεγάλων ζώων

18 Νέες πρόοδοι στην αλληλούχηση αρχαίου DNA
Η αλληλούχηση του μαμούθ Η πλήρης αλληλουχία του μιτοχονδριακού DNA επετεύχθη με “multiplex” PCR (ταυτόχρονη ενίσχυση πολλών στόχων--ιδανική για ελάχιστες ποσότητες DNA) Ανάκτηση 28 εκατ bp αλληλουχίας του "μεταγονιδιώματος" του μαμούθ, χρησιμοποιώντας πολύ βραχείες αλληλουχίες και την τεχνική pyrosequencing “είναι δυνατή η αλληλούχηση ολόκληρου του γονιδιώματος του μαμούθ, εγκαινιάζοντας το πεδίο της παλαιο-γονιδιωματικής”

19

20

21 H κλωνοποίηση του Pyrenean ibex
Pictured above is the process used to clone the Pyrenean ibex in The tissue culture was taken from the last living, female Pyrenean ibex (Capra pyrenaica pyrenaica) named Celia. The egg was taken from a goat (Capra hircus) and the nuclei removed to ensure the offspring was purely Pyrenean ibex. The egg was implanted into a surrogate goat mother for development. Following several failed attempts to revive the subspecies through cloning, a living specimen was born in However, this victory was short lived, as the specimen died several minutes later due to a lung defect.

22 Μοριακή Ανθρωπολογία Σύγκριση αλληλουχιών σύγχρονων ανθρώπων (γονιδιακή ροή, προέλευση, ποικιλομορφία) Σύγκριση αλληλουχιών μεταξύ σύγχρονων ανθρώπων και του κοντινότερου συγγενή -- Pan troglodytes, χιμπατζή -- Πού είναι οι διαφορές, ποια γονίδια επιλέγονται κατά την απόκλιση? Σύγκριση αλληλουχιών μεταξύ σύγχρονων ανθρώπων και εξαφανισμένων ανθρωποειδών -- Homo neanderthalensis

23 Neanderthals Οι Neanderthals είναι μια ομάδα εξαφανισμένων ανθρωποειδών που έζησαν στην Ευρώπη και τη δυτική Ασία (και στην Παλαιστίνη) περίπου πριν από 300,000 έως 30,000 χρόνια.

24 Neanderthals “Tal” στα Γερμανικά σημαίνει "κοιλάδα".
Ανακαλύφτηκαν στην κοιλάδα Neander, κοντά στο Dusseldorf το 1856.

25 Neanderthals Είναι γνωστό ότι συνυπήρξαν με τους "μοντέρνους" ανθρώπους (Homo sapiens) μέχρι πριν από 30-40,000 χρόνια. Πολλοί έχουν ισχυριστεί ότι: Είναι οι πρόγονοι των σημερινών Ευρωπαίων Συνεισέφεραν στη γονιδιακή δεξαμενή των σημερινών Ευρωπαίων Εξαφανίστηκαν και αντικαταστάθηκαν από τους σημερινούς Ευρωπαίους χωρίς γενετική συνεισφορά

26 Neanderthals Ένας τρόπος για να μάθουμε για τις φυλογενετικές σχέσεις μεταξύ των σημερινών ανθρώπων και των Neanderthals θα ήταν να αναλύσουμε αλληλουχίες DNA από απολιθώματα των Neanderthals: ancient DNA

27 Αρχαίο DNA Ομάδα ερευνητών του Zoological Institute, University of Munich προσπάθησε να προσδιορίσει την αλληλουχία DNA από το αρχικό δείγμα ανθρώπου του Neanderthal του 1856 Svante Paabo, επικεφαλής της ερευνητικής ομάδας

28 Δείγμα απομονωμένο από το δεξί βραχίονα Neanderthal
Αρχαίο DNA Δείγμα απομονωμένο από το δεξί βραχίονα Neanderthal Right Humerus of a modern humanoid

29 Μερικά λόγια για το mtDNA
Το μιτοχονδριακό DNA των ζώων είναι ένα κυκλικό μόριο kb και στα σπονδυλωτά περιέχει γονίδια για 22 tRNAs, 2 rRNAs και 13 mRNAs που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μεταφοράς ηλεκτρονίων και οξειδωτικής φωσφορυλίωσης. Η μόνη μη κωδική περιοχή του mtDNA είναι η περιοχή ελέγχου (~ 1 kb), που εμπλέκεται στη ρύθμιση της έναρξης της αντιγραφής και μεταγραφής του mtDNA.

30 Sequencing Με χρήση διαφορετικών εκκινητών και πολλαπλών PCR συντέθηκε η αλληλουχία 379 bp από τον άνθρωπο του Neanderthal.

31 Η αλληλουχία Έγινε, επίσης, σύγκριση της αλληλουχίας αυτής με 994 μιτοχονδριακές αλληλουχίες από διαφορετικές ομάδες σύγχρονων ανθρώπων: 478 Αφρικανοί, 510 Ευρωπαίοι, 494 Ασιάτες, 167 Γηγενείς Αμερικανοί 20 από Αυστραλία και Ωκεανία.

32 DNA of Neanderthals vs. Humans
Οι διαφορές των ανθρώπινων αλληλουχιών ήταν από 1 έως 24 υποκαταστάσεις. Οι διαφορές των ανθρώπινων αλληλουχιών από εκείνες του Neanderthal ήταν από 22 έως 36 υποκαταστάσεις. Η μέση τιμή των υποκαταστάσεων μεταξύ των ανθρώπινων ομάδων ήταν 8.0±3.1 Η μέση τιμή των υποκαταστάσεων μεταξύ ανθρώπων και Neandertal ήταν 27.2±2.2. Η απόσταση αυτή ήταν ίδια τόσο ως προς τους Ευρωπαίους όσο και ως προς τους υπόλοιπους σύγχρονους πληθυσμούς. Δηλαδή, παρότι οι Neanderthal έζησαν στην Ευρώπη δεν είναι στενότεροι συγγενείς των Ευρωπαίων.

33 DNA of Neanderthals vs. Chimps
Έγινε σύγκριση της αλληλουχίας με 16 σειρές χιμπατζήδων: (Σημείωση: εδώ συγκρίθηκαν μόνο οι κοινές νουκλεοτιδικές θέσεις ανάμεσα σε άνθρωπο και χιμπατζή) Ο μέσος αριθμός υποκαταστάσεων ανάμεσα στους ανθρώπους ήταν 8.0±3.0 Ο μέσος αριθμός υποκαταστάσεων ανάμεσα στον άνθρωπο και τον Neanderthal ήταν 25.6±2.2. Ο μέσος αριθμός υποκαταστάσεων ανάμεσα σε χιμπατζή και άνθρωπο ήταν 55.0±3.0 Συμπέρασμα: Οι Neanderthals είναι συγγενέστεροι των ανθρώπων παρά των χιμπατζήδων.

34 Ένα δέντρο Ένα φυλογενετικό δέντρο κατασκευάστηκε από 1 αλληλουχία Neanderthal, 16 αλληλουχίες χιμπατζήδων και 986 αλληλουχίες ανθρώπων. Χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος Neighbor-Joining. Chimps Africans+non-Africans 1 African 1 African, 1 African-American 4 Africans Neanderthal Συνεπώς: (a) Οι Neanderthal είναι ένα outgroup των ανθρώπων. (b) Οι άνθρωποι έχουν Αφρικάνικη καταγωγή. Αφού το μιτοχόνδριο είναι μητρικής προέλευσης, μπορούμε να ισχυριστούμε ότι η "Εύα ήταν Αφρικανή"…

35 Μοριακή χρονολόγηση Η πιο πρόσφατη αρχέγονη mtDNA αλληλουχία κοινή στους Neanderthal και τους μοντέρνους ανθρώπους υπήρξε πριν από 550,000 με 690,000 χρόνια. Η ζωή των ανθρώπων υπολογίζεται ανάμεσα στα 120,000 και 150,000 χρόνια Η μέθοδος: βαθμονόμηση: 4.05 εκατ χρόνια πριν απόκλιναν οι άνθρωποι και οι χιμπατζήδες. Αυτό συμφωνεί με την αρχαιολογική χρονολόγηση - λόγω πολυμορφισμών στους πληθυσμούς.

36 Μοντέλο εξάπλωσης μοντέρνων ανθρώπων
Neanderthal Modern human 2004 N = γενιές

37 Πυρηνική και μιτοχονδριακή συνεισφορά στην κληρονόμηση χαρακτήρων

38 Όμως, δεν βρέθηκαν καθόλου μιτοχόνδρια Neanderthal σε χιλιάδες μοντέρνους Ευρωπαίους που εξετάστηκαν. Αυτό συνάδει με βαθμό διασταυρώσεων λιγότερο του 0.1% ή Ο υψηλότερος βαθμός διασταύρωσης δεν είναι εμφανής λόγω της στειρότητας των αποτελεσμάτων των διασταυρώσεων (2004)

39 Ποια η αξία της πλήρους αλληλούχησης του γονιδιώματος του Neanderthal;
Έχουν υπάρξει “επιλογικές σαρώσεις” (selective sweeps) στο ανθρώπινο γονιδίωμα από την εποχή της διαφοροποίησης από τους Neanderthals? (selective sweep: μείωση ποικιλομορφίας στο γονιδιωματικό DNA που βρίσκεται κοντά σε μια μετάλλαξη που υφίσταται ισχυρές δυνάμεις επιλογής) Πώς ήταν η βιολογία των Neanderthal?

40 “Metagenome” from 38,000 year old bone
Πυρηνικές αλληλουχίες του Neanderthal – Πώς ήταν η γενετική των Neanderthal? Πώς συγκρίνονται με τους μοντέρνους ανθρώπους? “Απευθείας κλωνοποίηση χωρίς ενίσχυση” (απαλλαγή προβλημάτων-λαθών PCR ενίσχυσης) “Metagenome” from 38,000 year old bone

41 Μέσο μέγεθος τμημάτων ~ 50 bp. Σύνολο 65,250 bp (NE1)
Pyrosequencing versus Sanger: 99.89% agreement Πώς ξέρουμε ότι είναι υλικό Neanderthal (και όχι μόλυνση από μοντέρνους ανθρώπους); Μολύνσεις με ανθρώπινες μιτοχονδριακές αλληλουχίες: ~2% «Κακή ποιότητα» αλληλούχησης αρχαίου DNA Απουσία ανθρωπο-ειδικών SNPs από τις αλληλουχίες των Neanderthal

42 Vi80: Vindja Cave, Croatia
1 million bp of Vi-80 were sequenced

43 Majority of DNA from old samples: organisms that colonize after death…

44 Memories… Proposed time line for divergence …of the way we were

45 Αυτά τα τρία κομμάτια οστών Neanderthal πρόσφεραν την πρώτη μαρτυρία για διασταυρώσεις ανάμεσα σε Homo sapiens και Neanderthal

46 Svante Paabo (pictured here with a Neanderthal skull) led the research effort

47 Προβλήματα αλληλούχησης
Εξάλειψη DNA βακτηριακής και μυκητιακής προέλευσης (97% του γενετικού υλικού) Προστασία από επιμολύνσεις DNA ερευνητών Κατακερματισμός του DNA Αλληλούχηση 3 x 109 bp από 5 γραμμάρια οστών

48 1% έως 4% του DNA των μη Αφρικανικής προέλευσης σημερινών ανθρώπων έχει προσμίξεις DNA από Neanderthal. Το αντίθετο δεν ισχύει: το DNA του Neanderthal ΔΕΝ έχει προσμίξεις ανθρώπινου DNA. Αυτό υποδηλώνει ότι η πρόσμιξη έγινε μετά την αποχώρηση από την Αφρική ενός μικρού sapiens πληθυσμού και πριν την εξέλιξη του sapiens σε ξεχωριστές ομάδες της Ευρώπης και της Ασίας Το DNA του Neanderthal βρίσκεται διάσπαρτο στο ανθρώπινο γονιδίωμα, υποδηλώνοντας ότι δεν παρέχει κάποιο εξελικτικό πλεονέκτημα και είναι μονάχα ένα γενετικό απομεινάρι.

49

50

51

52 Ποιοι ήταν οι Denisovans

53

54 Οι άνθρωποι ως υβρίδια The hobbits of the Indonesian island of Flores.
Κακής ποιότητας DNA λόγω υγρού και ζεστού κλίματος.

55 FOXP2: ένα γονίδιο κλειδί της ανθρώπινης εξέλιξης που συνδέεται (
Μεταλλάξεις στο γονιδιακό αυτό τόπο οδηγούν σε προβλήματα "γλωσσολογικών επεξεργασιών" και "κινήσεων στόματος-προσώπου" Δύο συγκεκριμένες μεταλλάξεις στο FOX2P είναι αμετάβλητες ("fixed") ανάμεσα στους ανθρώπους και τους χιμπατζήδες Σχετικά πρόσφατα (πριν από ~200,000 χρόνια) υπήρξε μια "επιλογική/επιλεκτική σάρωση" (selective sweep) στην περιοχή του FOX2P του ανθρώπινου γονιδιώματος

56

57 Implication: FOXP2 variants not a guarantee of survival
Σίγουρα υπήρχαν και άλλες σημαντικές μεταλλάξεις (δομή / λειτουργία του εγκεφάλου;) Οι Neanderthals μάλλον μπορούσαν να μιλήσουν, αλλά ίσως να είχαν λίγα ενδιαφέροντα να πουν…

58

59 Το εξελικτικό ξεκίνημα της ανθρώπινης ομιλίας
Η ομιλία εξαρτάται από τον ακριβή συντονισμό των μυών του λάρυγγα και του στόματος. Μειωμένα επίπεδα της ρυθμιστικής πρωτεΐνης FOXP2 οδηγούν σε σημαντικά προβλήματα ομιλίας. Άτομα που πλήττονται από αυτό έχουν προβλήματα στην άρθρωση. Πιθανά γονίδια στόχοι της ρυθμιστικής πρωτεΐνης FOXP2 πιθανόν να κωδικοποιούν νευροδιαβιβαστές ή άλλα σημαντικά σήματα της ανάπτυξης του λάρυγγα.

60 Fig 19-17 summary of amino acid changes in the FOXP2 proteins of mice and primates.

61 Σύγκριση των αλληλουχιών του γονιδίου FOXP2 του ανθρώπου, χιμπατζή και ποντικού.

62 Ένα σενάριο για την εξέλιξη της ομιλίας στον άνθρωπο

63

64 Using whole-genome microarrays, we uncovered genes that are differentially regulated upon mutation of these two amino acids, including some with functions critical to the development of the human central nervous system. Moreover, this study reveals enrichment of differential FOXP2 targets with known involvement in cerebellar motor function, craniofacial formation, and cartilage and connective tissue formation, suggesting an important role for human FOXP2 in establishing both the neural circuitry and physical structures needed for spoken language. As suggested over 30 years ago, and reaffirmed by the sequencing of both the human and chimpanzee genomes, the phenotypic differences exhibited by humans and chimpanzees cannot be explained by differences in DNA sequence alone, and are probably due to differences in gene expression and regulation.

65 Ο άνθρωπος του Ötzi

66

67 Ανασταίνοντας εξαφανισμένα γονίδια: η φυλογενετική προσέγγιση
Ποια είναι (ήταν) η λειτουργία μιας προγονικής / ενδιάμεσης μορφής ενός σημερινού γονιδίου; Μόνο λίγα μοριακά απολιθώματα υπάρχουν και αυτά δεν είναι πολύ παλιά ΑΛΛΑ Υπάρχουν μέθοδοι που μας βοηθούν να συμπεράνουμε προγονικές γονιδιακές αλληλουχίες Το "υποθετικό προγονικό" γονίδιο μπορεί να συντεθεί, κλωνοποιηθεί, μπορεί να υπερεκφραστεί και η αντίστοιχη πρωτεΐνη μπορεί να απομονωθεί και να μελετηθεί…

68

69 Πώς συνάγουμε την αλληλουχία ενός προγονικού γονιδίου;
Maximum likelihood analysis: Κατασκευή φυλογενετικού δένδρου Σε κάθε εσωτερικό κόμβο, κάθε δυνατή προγονική κατάσταση εκτιμάται σε σχέση με την πιθανότητα να αποφέρει τις σημερινές αλληλουχίες Η κατάσταση με τη μεγαλύτερη πιθανότητα δίνει την καλύτερη υπόθεση προγονικής αλληλουχίας

70 A success story: προγονικός βακτηριακός EF-Tu
(>1 billion years ago) Σε ποιες θερμοκρασίες λειτουργεί καλύτερα ο προγονικός EF-Tu (ή: ήταν θερμόφιλα τα βακτήρια στο παρελθόν;) Ο ανακατασκευασμένος προγονικός EF-Tu συνδέεται με το GTP καλύτερα στους 65°C, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα βακτήρια αρχικά ήταν θερμόφιλα

71 Επιμήκυνση της μετάφρασης

72 Όμως: Πόσο καλή είναι η πρόβλεψη της μέγιστης πιθανότητας; Πολλές προβλέψεις πρέπει να εκτελεστούν και τα αποτελέσματα να συγκριθούν: δίνουν παρεμφερή αποτελέσματα; Αναλύεται η λειτουργία της προγονικής πρωτεΐνης στις σωστές συνθήκες; Αν η πρωτεΐνη λειτουργεί ως μέρος μεγαλύτερου συμπλόκου;

73 Κατανόηση λειτουργίας εξαφανισμένων γονιδίων

74