ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ELISA

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ELISA"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ELISA
ΑΣΚΗΣΗ 7 ΑΝΟΣΟΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΟΚΙΜΑΣΙΑ ELISA Πατήστε Esc να κλείσει η προβολή

2 ΒΑΣΙΚΗ ΑΡΧΗ ΤΗΣ ΜΕΘΟΔΟΥ
Anti-Ab Enzyme Ag ΤΟΙΧΩΜΑ Ab

3 Η ενζυμική δραστικότητα ανιχνεύεται με την παραγωγή εγχρώμου προϊόντος μετά την προσθήκη και την οξείδωση κατάλληλου δείκτη του ενζύμου (χρωμογόνο, υπόστρωμα). Η ποσότητα του παραγόμενου έγχρωμου προϊόντος είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ενζύμου η οποία με τη σειρά της είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του ειδικού αντισώματος που συνδέθηκε με το αντιγόνο.

4 ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΙΚΗ ΑΠΕΙΚΟΝΙΣΗ ΣΤΑΔΙΩΝ ELISA

5 ΠΡΟΣΡΟΦΗΣΗ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΑΝΤΙ ΤΟΥ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ

6 Ανταγωνιστική ELISA με σταθερή ποσότητα σημασμένου αντιγόνου (Competitive method)
*Το προς προσδιορισμό αντιγόνο και το σημασμένο αντιγόνο προστίθενται μαζί.

7 Μη-ανταγωνιστικές ΕLISA
(α) Κλασική έμμεση ELISA (β) ELISA σάντουιτς (Double antibody sandwich method) (γ) Τροποποιημένη σάντουιτς ELISA (Modified double antibody sandwich ELISA

8 Η επιτυχία της ELISA εξαρτάται από τους παρακάτω παράγοντες: (1) το αντιδραστήριο που ακινητοποιείται στο στερεό υπόστρωμα, (2) το αντίσωμα που επιλέγεται, (3) την παρασκευή του συζεύγματος, (4) το σύζευγμα και τον δείκτη του ενζύμου, και (5) τον τρόπο ανίχνευσης του τελικού προϊόντος.

9 Παρά τη μεγαλύτερη ευαισθησία που μπορούν να προσφέρουν οι μέθοδοι ανίχνευσης με φθορισμό ή φωταύγεια, οι χρωματομετρικές ανοσοενζυμικές μέθοδοι είναι πιο διαδεδομένες, λόγωτων πολλών τους πλεονεκτημάτων. Συνοπτικά προσφέρουν: οπτική, γρήγορη εκτίμηση των αποτελεσμάτων Απλή και σχετικά οικονομική φωτομέτρηση σε ελάχιστο χρόνο Σταθερότητα για αρκετό χρονικό διάστημα του εγχρώμου προϊόντος μετά τον τερματισμό της ενζυμικής αντίδρασης

10 Ag Ag = Πρωτεϊνη από L.m Ab Anti-Ab Enzyme
Ab = Ορός κουνελιού 1, ανοσοποιημένου με L.m. Ab = Ορός κουνελιού 2, ανοσοποιημένου με L.i. Anti-Ab Enzyme Anti-Ab = Ανοσοσφαιρίνες γίδας ανοσοποιημένης με φυσιολογικές ανοσοσφαιρίνες κουνελιού

11  ΠΕΙΡΑΜΑΤΙΚΗ ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ
1) Σε κάθε φρεάτιο των πλακών μικροτιτλοποίησης προσθέτουμε 100 λ διαλύματος αντιγόνου συγκέντρωσης 5 μg/ml σε ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης. Η πλάκα καλύπτεται με αυτοκόλλητο κάλυμμα και επωάζεται μία νύχτα στους 4οC. 2) Το ρυθμιστικό διάλυμα κάλυψης απομακρύνεται με αναστροφή της πλάκας, που πλένεται με το διάλυμα έκπλυσης 3-4 φορές με δύναμη. Στεγνώνεται με χαρτί. 3) Σε κάθε φρεάτιο τοποθετούνται 200 λ διαλύματος δέσμευσης μη-ειδικών θέσεων. Η πλάκα καλύπτεται και επωάζεται για 30 λεπτά στους 37ο C. 4) Το διάλυμα δέσμευσης απομακρύνεται όπως προηγουμένως και η πλάκα πλένεται με το διάλυμα έκπλυσης 3-4 φορές με δύναμη. Στεγνώνεται με χαρτί.

12 A B PBS C D E F G H 1:500 1:500

13 5) Στα κατάλληλα φρεάτια τοποθετούνται 100 λ διαδοχικών αραιώσεων των δειγμάτων. Η πλάκα καλύπτεται και επωάζεται για 45 λεπτά στους 37ο C. 6) Το υγρό απομακρύνεται όπως προηγουμένως και η πλάκα πλένεται με το διάλυμα έκπλυσης 3-4 φορές με δύναμη. Στεγνώνεται με χαρτί. 7) Σε κάθε φρεάτιο τοποθετούνται 100 λ διαλύματος αντισωμάτων σημασμένων με υπεροξειδάση σε διάλυμα έκπλυσης. Η πλάκα καλύπτεται και επωάζεται για 30 λεπτά στους 37ο C.

14 8) Το υγρό απομακρύνεται όπως προηγουμένως και η πλάκα πλένεται με το διάλυμα έκπλυσης 3-4 φορές με δύναμη. Στεγνώνεται με χαρτί. 9) Σε κάθε φρεάτιο τοποθετούνται 200 λ διαλύματος υποστρώματος. Η πλάκα καλύπτεται και επωάζεται για 10 λεπτά στο σκοτάδι και σε θερμοκρασία δωματίου. 10) Τέλος, η αντίδραση τερματίζεται με την προσθήκη σε κάθε φρεάτιο 25 λ διαλύματος H2SO4. 11) Η οπτική πυκνότητα (ΟD) καταγράφεται στα 450 nm σε φασματοφωτόμετρο πλακών μικροτιτλοποίησης.

15 » - - 2SD μάρτυρα ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΟΙ A B C D 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Ab για Lm Ab για Li (OD A1 + OD B1) 2 (OD A12 + OD B12) 2 - - 2SD μάρτυρα 0.05

16 ΔOD 450 Log Αραίωσης