ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Εφαρμογές της βιολογίας στην ιατρική»

Παρουσίαση με θέμα: "ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Εφαρμογές της βιολογίας στην ιατρική»"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΟ ΔΙΠΛΩΜΑ ΕΙΔΙΚΕΥΣΗΣ «Εφαρμογές της βιολογίας στην ιατρική»
Μοριακή Βιολογία: Αρχές και Μεθοδολογία Γονιδιωματική αποτύπωση: από το μηχανισμό στην ασθένεια Υπεύθυνοι μαθήματος: Γεώργιος Κ. Ροδάκης, Αναπλ.Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Δημήτριος Στραβοπόδης, Επικ.Καθηγητής Τμήματος Βιολογίας Επιμέλεια παρουσίασης: Τσακίρη Ελένη

2 Τι είναι γονιδιωματική αποτύπωση ή εντύπωμα??
Το φαινόμενο κατά το οποίο ένα αλληλόμορφο εκφράζεται ανάλογα με την κατάσταση μεθυλίωσης του που εξαρτάται από ποιο γονέα κληρονομήθηκε.

3 Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ.183
Απαραίτητη προυπόθεση για τη φυσιολογική ανάπτυξη του ζυγωτού είναι το ωάριο να περιέχει έναν προπυρήνα πατρικής προέλευσης και έναν μητρικής προέλευσης. Τα παρθενογενετικά διπλοειδή έμβρυα , τα οποία προκύπτουν με από ενεργοποίηση του ωαρίου με καταστολή του σχηματισμού του δεύτερου πολικού σωματίου, δεν αναπτύσσονται φυσιολογικά λόγω ανεπαρκούς σχηματισμού των εξωεμβρυικών ιστών. Στα ανδρογενετικά διπλοειδή άτομα, τα οποία δημιουργούνται με αφαίρεση του θηλυκού προπυρήνα και ένεση ενός δεύτερου αρσενικού προπυρήνα, η ανάπτυξη των εξωεμβρυικών ιστών είναι επαρκής, αλλά η ανάπτυξη του εμβρύου σταματά σε ένα πρώιμο στάδιο. Τα παραπάνω αποτελέσματα οφείλονται στην ύπαρξη, σε αρκετά χρωμοσώματα, εντυπωμένων γονιδίων. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ.183

4 Παράδειγμα εντυπώματος στα ποντίκια…(Igf2)
Πατρικό Μητρικό Igf2 μη ενεργό Igf2 ενεργό Παρόλου που υπάρχουν πολλά άλλα εντυπωμένα γονίδια, το σύστημα igf2 φαίνεται να αποτελεί τον πιο σημαντικό φραγμό στην ανάπτυξη παρθενογενετικών εμβρύων. Εάν ένα ωοκύτταρο υποβληθεί σε κατάλληλους μικροχειρισμούς, έτσι ώστε να περιέχει τελικά δύο απλοειδείς θηλυκούς προπυρήνες από τους οποίους ο ένας έχει τροποποιηθεί και εκφράζει το igf2, όπως συμβαίνει και σε ένα πατρικό πυρήνα,τότε το έμβρυο αυτό αναπτύσσεται ως τη γέννηση. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ.184

5 IGF2 Το γονίδιο Igf2 βρίσκεται στη χρωμοσωμική θέση 11p15.5 μια περιοχή που περιέχει πολλά εντυπωμένα γονίδια στον άνθρωπο, ενώ στον ποντικό τοποθετείται στο χρωμόσωμα 7. Κωδικοποιεί για ένα αυξητικό παράγοντα που προάγει την προγεννητική αύξηση του εμβρύου. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ.184

6 Παράδειγμα εντυπώματος στα ποντίκια…(Igf2)
Πατρικό Μητρικό Igf2 μη ενεργό Igf2 ενεργό Παρόλου που υπάρχουν πολλά άλλα εντυπωμένα γονίδια, το σύστημα igf2 φαίνεται να αποτελεί τον πιο σημαντικό φραγμό στην ανάπτυξη παρθενογενετικών εμβρύων. Εάν ένα ωοκύτταρο υποβληθεί σε κατάλληλους μικροχειρισμούς, έτσι ώστε να περιέχει τελικά δύο απλοειδείς θηλυκούς προπυρήνες από τους οποίους ο ένας έχει τροποποιηθεί και εκφράζει το igf2, όπως συμβαίνει και σε ένα πατρικό πυρήνα,τότε το έμβρυο αυτό αναπτύσσεται ως τη γέννηση. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ184

7 Genes VIII σελ 961& J.M.W. SLACK σελ184
Κατά τη γαμετογένεση διαγράφεται το αρχικό πρότυπο μεθυλίωσης και στη συνέχεια εντυπώνεται το ειδικό πρότυπο μεθυλίωσης κάθε φύλου.Στα θηλυκά άτομα τα εντυπώματα εγκαθιδρύονται κατά την όψιμη φάση της γαμετογένεσης , στη φάση της αύξησης του ωοκυττάρου, ενώ στα αρσενικά αυτό συμβαίνει σε πιο πρώιμο στάδιο της σπερματογένεσης. Παραμένει ασαφής ο μηχανισμός μέσω του οποίου εγκαθιδρύονται αρχικά τα εντυπώματα.Εντούτοις είναι γνωστό ότι η διατήρηση τους γενικά συσχετίζεται με τη μεθυλίωση του DNA σε αυτά τα γονίδια. Genes VIII σελ 961& J.M.W. SLACK σελ184

8 Η DNA μεθυλάση παίζει το κυριο ρόλο στο εντύπωμα…
Μετάλλαξη στο γονίδιο της αντίστοιχης DNA μεθυλάσης(Dnmt1)σε ποντίκια προκαλεί ανώμαλη μεθυλίωση των νησιδίων CpG οδηγώντας σε λανθασμένη γονιδιακή έκφραση. [ Li et al. 1993]

9 Ακόμα η μεθυλoτρανσφεράση Dnmt3 παίζει κρίσιμο ρόλο στη διατήρηση της διαφορετικής μεθυλίωσης μεταξύ των θηλυκών και αρσενικών γαμετικών κυττάρων. [Kaneda et al. 2004; Kato et al. 2007] Η μητρική αλλά και η ζυγωτική Dnmt1 είναι σημαντικές για τη διατήρηση του εντυπώματος κατά τη προεμφυτευτική ανάπτυξη. [ Hirasawa et al. 2008]

10 Η ρύθμιση των εντυπωμένων γονιδίων εξαρτάται από τη μεθυλίωση cis-δραστικών θέσεων.
Το εντύπωμα καθορίζεται από τη μεθυλίωση μιας cis-δραστικής θέσης κοντά σε ένα ή περισσότερα γονίδια-στόχους. DMDs(Differentially Methylated Domains) ή περιοχές ελέγχου του εντυπώματος(ICR, Imprinting Control Regions). Ελλείματα σε αυτές τις θέσεις αίρουν το εντύπωμα, με αποτέλεσμα οι γενετικοί τόποι-στόχοι να συμπεριφέρονται με τον ίδιο τρόπο είτε προέρχονται από το μητρικό είτε από το πατρικό γονιδίωμα. Genes VIII σελ

11 Η μεθυλίωση της περιοχής ICR ρυθμίζει την έκφραση των γονιδίων Igf2 και Η19.
Η συμπεριφορά μιας περιοχής του γονιδιώματος που περιλαμβάνει δύο γονίδια, τα Igf2 και H19, αποτελεί ένα τυπικό παράδειγμα των διαφορετικών τρόπων με τους οποίους η μεθυλίωση μπορεί να ρυθμίζει τη γονιδιακή έκφραση. Στην εικόνα φαίνεται ότι τα δύο γονίδια αποκρίνονται με αντίθετο τρόπο στη μεθυλίωση μιας περιοχής ICR που βρίσκεται ανάμεσα τους. Όταν η ICR δεν είναι μεθυλιωμένη, προσδένεται σε αυτήν η πρωτεΐνη CTCF δημιουργώντας έναν μονωτή που παρεμποδίζει την ενεργοποίηση του υποκινητή του Igf2 από έναν εξειδικευμένο ενισχυτή. Πρόκειται για ένα ασυνήθιστο φαινόμενο κατά το οποίο η μεθυλίωση ενεργοποιεί έμμεσα ένα γονίδιο παρεμποδίζοντας τη λειτουργία του μονωτή. Me Me Genes VIII σελ

12 Δύο θεωρίες για την εξήγηση της γονιδιωματικής αποτύπωσης
Moore, T & Haig, D.(1991) Θεωρία του γενετικού ανταγωνισμού Iwasa, Y.(1998) Θεωρία γονιδιακής ισοστάθμισης Iwasa, Y et al, 1998 Review Moore, T & Haig, D 1991

13 Moore, T & Haig, D.(1991) Θεωρία του γενετικού ανταγωνισμού
Γονίδια υπεύθυνα για την εμβρυϊκή ανάπτυξη εκφράζονται από τα πατρικά αλληλόμορφα, ενώ γονίδια υπεύθυνα για την αναστολή της ανάπτυξης εκφράζονται από τα μητρικά αλληλόμορφα. Μία εξήγηση για το φαινόμενο αυτό είναι δυνατόν να δοθεί με βάση την εξέλιξη, καθώς η φυσική επιλογή ευνοεί άτομα που διαθέτουν γνωρίσματα τα οποία μεγιστοποιούν τον αριθμό των απογόνων. Στο αρσενικό άτομο ο μέγιστος αριθμός απογόνων επιτυγχάνεται εάν αυτό ζευγαρώνει με πολλά θηλυκά και τα έμβρυα του χαρακτηρίζονται από το μέγιστο ρυθμό αύξησης σε σχέση με έμβρυα-απόγονους άλλων αρσενικών. Στα θηλυκά άτομα ο μέγιστος αριθμός απογόνων επιτυγχάνεται εάν πραγματοποιήσουν όσο το δυνατόν περισσότερους άλλους αναπαραγωγικούς κύκλους. Για να επιτύχουν όσο το δυνατόν περισσότερους κύκλους, τα θηλυκά πρέπει πρέπει να δαπανούν περιορισμένους πόρους για τα έμβρυα τους και να είναι σε θέση να επιβιώσουν από τη γέννα.

14 Iwasa, Y.(1998) Θεωρία γονιδιακής ισοστάθμισης
Υποστηρίζει ότι η γονιδιωματική αποτύπωση μπορεί να εξελίχθηκε για να αποφευχθεί ο κίνδυνος δημιουργίας παρθενογενετικού εμβρύου. Αναφέρεται στα γονίδια των Χ χρωμοσωμάτων. Υποστηρίζει ότι η γονιδιωματική αποτύπωση συμβαίνει για να ισοσταθμίσει την ποσότητα των προϊόντων αυτών των γονιδίων. Ωστόσο υπάρχουν κάποια πράγματα που διαφεύγουν από την προηγούμενη θεωρία, είναι τα εξής: Κάποια γονίδια επηρεάζουν την ανάπτυξη αλλά δεν αποτυπώνονται π.χ. Igf1 Υπάρχει ένα γονίδιο που είναι αναγκαίο για την εμβρυϊκή ανάπτυξη(Mash2) αλλά δεν ακολουθεί τη προηγούμενη θεωρία Όπως και τα γονίδια του χρωμοσώματος Χ → Επειδή τα θηλυκά παίρνουν διπλή δόση από Χ χρωμοσώματα, αποτρέπουν την έκφραση ορισμένων από αυτά με την αποτύπωση.

15 Σύνδρομα Prader-Willi και Angelman
Beckwith-Wiedemann Syndrome(BWS)-Silver Russel Όγκος Wilms Birk Barel Mental Retasdation Dysmorphism

16 Angelman και Prader-Willi
→μία μικροέλλειψη στη χρωμοσωμική περιοχή 15q11-q13 μεγέθους 4Mb… … όταν κληρονομείται από τον πατέρα παρατηρείται το σύνδρομο Prader-willi ενώ όταν κληρονομείται από τη μητέρα παρατηρείται το σύνδρομο Angelman. Ο λόγος είναι ότι η περιοχή φέρει τουλάχιστον ένα γονίδιο που εντυπώνεται πατρικά και τουλάχιστον ένα που εντυπώνεται μητρικά. Genes VIII σελ 963

17 Angelman και Prader-Willi
Το σύνδρομο Prader-willi μπορεί να προκληθεί από ένα έλλειμμα 20kb το οποίο απενεργοποιεί μακρινά γονίδια που βρίσκονται πέρα από τα δύο άκρα του εντυπωμένου γονιδίου. Genes VIII, σελ 963

18 Angelman και Prader-Willi
Η αιτία των σπάνιων αυτών περιπτώσεων είναι ότι η περιοχή του ελλείμματος συνιστά κάποιο είδος «κέντρου εντυπώματος», το οποίο επιδρά σε γενετικούς τόπους που βρίσκονται σε μεγάλη απόσταση και τους μετατρέπει από τον ένα γονικό τύπο στον άλλο. Genes VIII σελ 963

19 Σύνδρομα Prader-Willi και Angelman
Beckwith-Wiedemann Syndrome(BWS)-Silver Russel Birk Barel Mental Retasdation Dysmorphism Όγκος Wilms

20 Beckwith-Wiedemann Syndrome(BWS)-Silver Russel
Είναι αποτέλεσμα μεταλλαγών στην έκφραση ή στη λειτουργία της ομάδας εντυπωμένων γονιδίων που βρίσκονται στη χρωμοσωμική θέση 11p15, περιλαμβάνοντας το Igf2 και το CDKN1C. BWS Silver-Russel To CDKN1C είναι ογκοκατασταλτικό γονίδιο που ρυθμίζει αρνητικά τον κυτταρικό κύκλο. Κλινική εικόνα BWS:γιγαντισμός, μακρογλωσσία, οφθαλμικές ανωμαλίες, συχνά μετά τη γέννηση εμφανίζουν νεφρικές ανωμαλίες και έχουν αυξημένο κίνδυνο για την ανάπτυξη καρκίνων. Κλινική εικόνα Silver-Russel: ανορεξία, χαμηλό βάρος κατά τη γέννηση, ασσυμετρία του σώμάτος(η μία πλευρά του σώματος μεγαλώνει πιο αργά από την άλλη), τριγωνικό πρόσωπο, μια μπλε χροιά στο άσπρο του ματιού σε νεαρά άτομα, καρδιακές ανωμαλίες και αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Αλληλόμορφα του γονιδίου NLRP2 (19q13.4) ενέχονται στο BWS. Άλλη αιτία του συνδρόμου silver-Russel είναι ότι το άτομο λαμβάνει 2 αντίγραφα του χρωμοσώματος 7 από τη μητέρα. Meyer E, Lim D, Pasha S, Tee Lj, Rahman F, et al(2009) The American Journal of Human Genetics 83, , August 8,2008

21 Σύνδρομα Prader-Willi και Angelman
Beckwith-Wiedemann Syndrome(BWS)-Silver Russel Birk Barel Mental Retasdation Dysmorphism Όγκος Wilms

22 Birk Barel Mental Retasdation Dysmorphism
Η ασθένεια οφείλεται σε μία μετάλλαξη του γονιδίου KCNK9 που προέρχεται από τη μητέρα. Ο πολυμορφισμός G770Α έχει ως αποτέλεσμα την αντικατάσταση της γλυκίνης με αργινίνη στη θέση 236 και την παραγωγή μη λειτουργικής πρωτεΐνης. Το γονίδιο KCNK9(7,27Mb και εντοπίζεται στο 8q24) κωδικοποιεί για δίαυλο καλίου, και εκφράζεται στη παρεγκεφαλίδα. Κλινική εικόνα: διανοητική καθυστέρηση, υποτονία σε νεαρή ηλικία που ακολουθείται από αδυναμία των μυών, δυσμορφία με μακρύ πρόσωπο, λεπτά χείλη που το στόμα χαρακτηρίζεται ως «στόμα ψαριού», υπερκινητικότητα. Η μεταλλαγή καταργεί μία θέση περιορισμού του περιοριστικού ενζύμου NlaIV που επιτρέπει την εύκολη ανάλυση των υγιών από τους ασθενείς. The American Journal of Human Genetics 83, , August 8,2008

23 Σύνδρομα Prader-Willi και Angelman
Beckwith-Wiedemann Syndrome(BWS)-Silver Russel Birk Barel Mental Retasdation Dysmorphism Όγκος Wilms

24 Όγκος Wilms Απώλεια του εντυπώματος του Igf2 στο χρωμόσωμα που δεν εκφράζεται φυσιολογικά έχει ως αποτέλεσμα το διπλασιασμό της φυσιολογικής δόσης του γονιδίου. Αδρανοποίηση του γονιδίου Η19 Συνδυάζεται και με διάφορες συγγενείς χρωμοσωμικές ανωμαλίες. Ο όγκος Wilms ή νεφροβλάστωμα είναι τρίτος κατά σειρά συχνότητα συμπαγής όγκος της παιδικής ηλικίας. Είναι κακοηθές νεόπλασμα που προέρχεται από εβρυικά κύτταρα και αναπτύσσονται σε όλο το νεφρικό παρέγχυμα. Η διάγνωση τίθεται συνήθως στην ηλικία των 3 ετών. Συνυπάρχει με γενετικές ανωμαλίες όπως ανιριδία, σύνδρομο BSW. Κλινική εικόνα: αδιαθεσία, απώλεια βάρους, αναιμία, υπέρταση λόγω πίεσης ή διήθηση της νεφρικής αρτηρίας από τον όγκο, θρόμβος στην κάτω κοίλη φλέβα→καρδιακή δυσλειτουργία. Βασικές Αρχές Βιολογίας Ανάπτυξης J.M.W. SLACK σελ184

25 WT1, p57KIP2 και το M6P/IGF2R είναι εντυπωμένα γονίδια που εμπλέκονται στην καταστολή του όγκου.
Tο γονίδιο p57KIP2, που τοποθετείται στο χρωμόσωμα 11p15.5,κωδικοποιεί έναν αναστολέα κυκλινοεξαρτώμενης κινάσης με μητρική έκφραση. Έχει παρατηρηθεί ότι το αλληλόμορφο αυτό δεν εκφράζεται σε όγκους και σε ασθενείς με BWS. Thompson JS et al,1996 Jinno Y et al, 1994 Hatada I et al,1996 De Souza AT et al,1995

26 Imprinting in behavior development
Δείχθηκε σε ποντίκια ότι το γονίδιο Mest, το οποίο εκφράζεται από τον πατέρα, δρα σαν θετικός ρυθμιστής της εμβρυϊκής ανάπτυξης, και παίρνει μέρος στη ρύθμιση της θηλυκής συμπεριφοράς όσον αφορά στην ανατροφή των απογόνων τους. Lefebvre et al,Nat Genet 1998, 20:163–169

27 Γονιδιωματική αποτύπωση και αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ
Μελέτη της έκφρασης του γονιδίου Xist σε ποντίκια έδειξε: → Στο πατρικό Χ χρωμόσωμα εκφράζεται για πρώτη φορά στο στάδιο των 4-8 κυττάρων. → Στο μητρικό χρωμόσωμα εκφράζεται 5,5-6,5 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση. → Το γονίδιο Xist υφίσταται αποτύπωση . Kay G.F. et al, 1994 (cell 77: )

28 Γονιδιωματική αποτύπωση και αδρανοποίηση του χρωμοσώματος Χ
Xist Tsix Ανακαλύφθηκε πρόσφατα ότι στα έμβρυα των ποντικιών το μη αδρανοποιημένο Χ χρωμόσωμα εκφράζει και αυτό με τη σειρά του ένα γονίδιο, το Tsix, το οποίο ενεργά το προστατεύει από το να καλυφθεί από το Xist-RNA. Τα μητρικά Χ χρωμοσώματα στους εξωεμβρυΐκούς ιστούς του ποντικιού εκφράζουν το ίδιο προστατευτικό γονίδιο Tsix, το οποίο ενεργά με τη σειρά του φροντίζει να μην αδρανοποιηθεί το μητρικό Χ χρωμόσωμα κατά τη γονιδιωματική αποτύπωση. Chao et al, 2002(science vol.295, )

29 Μοιάζει με περιοχή που προσδένεται ο παράγοντας CTCF
CTCF και Tsix Μοιάζει με περιοχή που προσδένεται ο παράγοντας CTCF 3΄ 5΄ Μη CpG Me CpG Me Στο 5΄ άκρο του γονιδίου Tsix βρίσκεται ένα σημαντικό cis κέντρο που όταν υποστεί μετάλλαξη καταστρέφεται η επιλεκτική αδρανοποίηση του πατρικού Χ χρωμοσώματος στις εξωεβρυΐκές κυτταρικές σειρές. Το τμήμα αυτό έχει μήκος 2-4 kb και περιέχει θέσεις πρόσδεσης για τον μεταγραφικό παράγοντα CTCF. καταστρέφεται η επιλεκτική αδρανοποίηση του Χ χρωμοσώματος Μη πρόσδεση του CTCF στο υπό CpG μεθυλίωση γονίδιο H19 Ο CTCF επηρεάζεται τόσο από μεθυλίωση CpG όσο και από μη-CpG μεθυλίωση Chao et al, 2002 (science vol.295, ).

30 Συμπεράσματα… Τα εντυπωμένα γονίδια μερικές φορές σχηματίζουν συμπλέγματα. Οι μηχανισμοί εντυπώματος να λειτουργούν σε μεγάλες αποστάσεις(κέντρα εντυπώματος). Ρύθμιση των εντυπωμένων γονιδίων εξαρτάται από τη μεθυλίωση cis-δραστικών θέσεων(ICR). Η μεθυλίωση μπορεί να ευθύνεται είτε για την ενεργοποίηση είτε για την απενεργοποίηση ενός γονιδίου. Η γονιδιακή αποτύπωση είναι ένα είδος επιγενετικής τροποποίησης, δηλαδή δημιουργεί αλλαγές στον φαινότυπο του ατόμου χωρίς να επιφέρει αλλαγές στην αλληλουχία βάσεων του DNA. Genes VIII Am.J.Hum.Genet. 67: ,2000

31 ΣΑΣ ΕΥΧΑΡΙΣΤΩ Genes Genet. Syst. (2007) 82, p