ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΟΛΙΤΗ ΜΑΡΙΑ Α.Μ. 4945 Β’ ΕΤΟΣ.

Παρουσίαση με θέμα: "ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΟΛΙΤΗ ΜΑΡΙΑ Α.Μ. 4945 Β’ ΕΤΟΣ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑ ΠΟΛΙΤΗ ΜΑΡΙΑ Α.Μ. 4945 Β’ ΕΤΟΣ

2 Serca2- Ελεγχόμενη από ιόντα ασβεστίου –ρυθμίζει την κερατινοκυτταρική προσκόλληση και διαφοροποίηση που διαμεσολαβούν μέσω της σφιγγολιπιδιακής διόδου : ένας θεραπευτικός στόχος για την ασθένεια του Darier

3 Εισαγωγικά Serca είναι μία ΑTPάση ασβεστίου που μεταφέρει ιόντα ασβεστίου από το κυτταρόπλασμα στο ενδοπλασματικό δίκτυο Υπάρχουν 3 είδη Serca, τα οποία εκφράζονται σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων :  SERCA1- γονίδιο ATP2A1 SERCA2-γονίδιο ATP2A2 SERCA3-γονίδιο ATP2A3

4 Η ATP2A2 είναι μία ATPάση ενδοπλασματικού δικτύου όπου μία μετάλλαξη του γονιδίου της προκαλεί την ασθένεια του Darier. Όμως και άλλα γονίδια ή περιβαλλοντικοί παράγοντες επηρεάζουν την έκφραση της νόσου . Η ασθένεια του Darier είναι μία κληρονομούμενη ασθένεια του δέρματος, που χαρακτηρίζεται από βλατίδες και πλάκες κυρίως στο δέρμα, στο στήθος, στον τράχηλο, στην πλάτη, στο πρόσωπο και στο κρανίο. Η ιστοπαθολογία του δέρματος αποκαλύπτει μειωμένη διαφοροποίηση και παθολογική απόπτωση. Η σηματοδότηση ιόντων ασβεστίου εμπλέκεται στην κερατινοκυτταρική και επιδερμική διαφοροποίηση, στην προσκόλληση των κυττάρων και στην απόπτωση.

5 Η εισροή ιόντων ασβεστίου μέσω διαπερατών καναλιών οδηγεί στη δημιουργία κόμβων που περιέχουν E-cadherin. Η E-cadherin είναι γνωστή ως δομική πρωτεΐνη αλλά έχει και σημαντικές λειτουργίες σηματοδότησης, καθώς 2 κινάσες που περιέχονται μέσα στο σύμπλεγμά της διατηρούν την παρατεταμένη αύξηση ιόντων ασβεστίου-απαραίτητη για την κυτταρική διαφοροποίηση.

6 Ο μεταβολισμός της σφιγγοσίνης στα κερατινοκύτταρα
Ο σφιγγολιπιδιακός μεταβολισμός αποτελεί ένα συμπληρωματικό σύστημα σηματοδότησης ιόντων ασβεστίου στα κερατινοκύτταρα. Ενισχυμένα επίπεδα της ενδοκυττάριας 1-φωσφορικής σφιγγοσίνης (S1P): 1) αυξάνουν τα επίπεδα των ιόντων ασβεστίου με άμεση κινητοποίηση αυτών από τη thapsigargin (TG) 2)ενισχύουν την ανάπτυξη των κερατινοκυττάρων και τη διαφοροποίηση και μπλοκάρουν την απόπτωση Ενεργοποίηση κινάσης της σφιγγοσίνης (SPHK1) αυξάνει την ενδοκυττάρια S1P. Τα επίπεδα της S1P μπορούν να αυξηθούν με την αναστολή της φωσφορικής λυάσης της σφιγγοσίνης(SGPL1).

7 H thapsigargin(TG) είναι αναστολέας της SERCA
Η δεσμοπλακίνη είναι πρωτεΐνη που συνδέεται με δεσμοσώματα. Τα δεσμοσώματα είναι κόμβοι που συνδέουν σφιχτά τα γειτονικά κύτταρα.

8 Ο μεταβολισμός της σφιγγοσίνης ελέγχεται από τη SERCA2
Φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα έλαβαν 100 nΜ TG για 2 ώρες, που προκαλούν αδρανοποίηση της SERCA2. Τα επίπεδα σφιγγοσίνης μετρήθηκαν με τη μέθοδο HPLC (ανάλυση σφιγγοσίνης) 24 και 48 ώρες μετά την προσθήκη TG. Βρήκαμε ότι χαμηλές συγκεντρώσεις των TG (100nΜ) αύξησαν τη συγκέντρωση της σφιγγοσίνης και άρα η αδρανοποίηση της SERCA2 αυξάνει τη σφιγγοσίνη.

9 Άρα η αναστολή της SERCA2b μειώνει την έκφραση της SPHK1 και αναπαράγει ελαττώματα στην ανάπτυξη των κυττάρων, την προσκόλληση και τη διαφοροποίηση που εντοπίζονται στην ασθένεια του Darier. Δηλαδή αυξημένη σφιγγοσίνη ενισχύει το θάνατο κυττάρων. ενώ αυξημένα επίπεδα της S1P προωθούν ανάπτυξη και βιωσιμότητα. Η αναστολή της SGPL1 αυξάνει την S1P και βελτιώνει τα ελαττώματα στη διαφοροποίηση, στην επεξεργασία E-cadherin και στη μετατόπιση δεσμοπλακίνης(DP).

10 Η έκφραση της SPHK1 μειώνεται μετά την αναστολή της SERCA2
Φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα έλαβαν 10 και 100 nΜ TG για 2 ώρες και μετρήθηκαν σε 24(γκρι γραμμές) και 48 ώρες(μαύρες γραμμές) και σε ξεχωριστό πείραμα έλαβαν siRNA και μετρήθηκαν σε 48 ώρες. Ανιχνεύθηκε μειωμένη έκφραση της κινάσης της σφιγγοσίνης(SPHK1). Και τα siRNA και η TG χρησιμοποιήθηκαν για να αδρανοποιήσουν την SERCA2. Η έκφραση της SPHK1 εκτιμήθηκε με αντίστροφη μεταγραφή- PCR.

11 Τα ιόντα ασβεστίου στο ενδοπλασματικό δίκτυο είναι σημαντικά για τη φυσιολογική σηματοδότηση και διαφοροποίηση των κερατινοκυττάρων. Μειωμένα επίπεδα E-cadherin μπορεί άμεσα να οδηγήσουν σε μειωμένη προσκόλληση κυττάρων μέσω μειωμένου σχηματισμού των κόμβων.

12 Ανθρώπινα κερατινοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν 0
Ανθρώπινα κερατινοκύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσα που περιέχουν 0.06mΜ ιόντα ασβεστίου. Μερικά από τα κύτταρα είχαν επιμολυνθεί με siRNA για 8 ώρες και μετά 10nΜ TG προστέθηκαν. Μετά από 2 ώρες έκθεσης σε TG, το μέσο ανάπτυξης αντικαταστήθηκε με 1,2mΜ ιόντων ασβεστίου για πρόκληση διαφοροποίησης. Το Hyperfect αντιδραστήριο επιμόλυνσης (Quiagen) χρησιμοποιήθηκε για όλες τις siRNA επιμολύνσεις.

13 (α) τα κύτταρα παρουσιάζουν φυσιολογική μορφολογία: πυκνά και ισοπεδωμένα μετά από 48 ώρες σε υψηλά επίπεδα ασβεστίου (b και c) κύτταρα με κωδικοποιημένο siRNA ή με SGPL1 siRNA δεν παρουσιάζουν μορφολογικές διαφορές απ’ τα μη επεξεργασμένα κύτταρα

14 (d) Η ποσότητα των 10 nΜ TG παράγει μεγαλύτερα κερατινοκύτταρα που δεν έχουν ισοπεδωθεί δηλαδή παρατηρείται ανώμαλη μορφολογία και ανώμαλη ανάπτυξη. (e) Η προσθήκη κωδικοποιημένου siRNA στα κατεργασμένα TG κύτταρα δεν έχει καμία επίδραση.

15 (f) Tα κύτταρα που έλαβαν τόσο TG όσο και siRNA επιδεικνύουν μορφολογία παρόμοια με αυτή των κερατινοκυττάρων ελέγχου δηλαδή η αναστολή της SGPL1 απ’ το siRNA έσωσε αυτά τα ελαττώματα που παρατηρούνται στη μορφολογία των κερατινοκυττάρων.

16 Τα ελαττώματα που παρατηρούνται στη σύνθεση και επεξεργασία της involucrin και E-cadherin ομαλοποιούνται με αναστολή της SGPL1. Τα πρωτεϊνικά επίπεδα των E-cadherin και involucrin αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ανοσοαποτύπωση κατά Western. Αυτή έδειξε ότι η αναστολή της SERCA2 με TG οδήγησε σε ελλείψεις στην πρωτεϊνική σύνθεση involucrin και E-cadherin και άρα στην ασθένεια του Darier. Αυτές οι ανωμαλίες θα μπορούσαν να εξομαλυνθούν με αναστολή της SGPL1. Βρέθηκε ότι η αναστολή της SGPL1 ήταν πιο αποτελεσματική για την ομαλοποίηση των ελαττωμάτων στην involucrin.

17 Ο ενδοκυττάριος εντοπισμός και η επεξεργασία της E-cadherin μπορούν να διαταραχθούν όταν τα ιόντα ασβεστίου στο ενδοπλασματικό δίκτυο εξαντληθούν. Για να διαπιστωθεί αυτό, χρησιμοποιήθηκε η μέθοδος ανοσοϊστοχημεία, όπου τα κύτταρα χρώστηκαν με ένα αντίσωμα που δεσμεύεται και βάφει τον εξωκυττάριο ή τον ενδοκυττάριο επίτοπο της E-cadherin.

18 (a-d) Κερατινοκύτταρα καλλιεργούνται σε 1
(a-d) Κερατινοκύτταρα καλλιεργούνται σε 1.2 mM ιόντων ασβεστίου για 48ώρες και βάφτηκαν με ένα αντίσωμα E-cadherin που αναγνωρίζει τον εξωκυττάριο επίτοπο. (e-h) Κερατινοκύτταρα που καλλιεργούνται σε 1.2 mM ιόντων ασβεστίου για 48ώρες βάφτηκαν με ένα αντίσωμα E-cadherin που αναγνωρίζει τον ενδοκυττάριο επίτοπο. (a and e) Κερατινοκύτταρα ελέγχου.

19 (a)Η E-cadherin φυσιολογικά ανταποκρίνεται στο να εγείρει τα εξωκυττάρια ιόντα ασβεστίου σχηματίζοντας συνεχείς μεσοκυττάριες συνδέσεις. (e) Μετά την αύξηση των εξωκυτταρίων ιόντων ασβεστίου, η συντριπτική πλειοψηφία της E-cadherin βρέθηκε σε κόμβους κυττάρων.

20 (c and g) Κωδικοποιημένα siRNA δεν μπορούν να φανερώσουν την εξωκυττάρια ή ενδοκυττάρια εντόπιση της E-cadherin . (d) Η αναστολή της SGPL1 με το siRNA αποκαθιστά συνεχή και λεπτή την εξωκυττάρια εντόπιση της E-cadherin Άρα τα ελαττώματα στον εντοπισμό της E-cadherin ομαλοποιήθηκαν από την αναστολή της SGPL1.

21 Αυτές οι μελέτες αποδεικνύουν ότι τα ελαττώματα που εμφανίζονται στην προσκόλληση κυττάρων στην ασθένεια του Darier μπορεί να οφείλονται σε ελαττωματικό εντοπισμό της E-cadherin.

22 Για να διερευνηθούν περαιτέρω οι επιπτώσεις της αδρανοποίησης της SERCA2, θα αξιολογείται η επίδραση των 10 nΜ TG στον εντοπισμό της δεσμοπλακίνης που έχει διαταραχθεί εξαιτίας της αδρανοποίησης της SERCA2. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιείται πάλι η μέθοδος της ανοσοϊστοχημείας αλλά με χρώση δεσμοπλακίνης.

23 Μέθοδος: ανοσοϊστοχημεία
Η χρώση δεσμοπλακίνης των ανθρώπινων κερατινοκυττάρων που έλαβαν 10 nM TG, 3ώρες (d–f) και 48 ώρες (j–l) μετά την αύξηση της εξωκυττάριας ποσότητας ιόντων ασβεστίου. Για δεσμοπλακίνη ανοσοφθορισμού, χρησιμοποιήθηκε ένα ποντίκι mAb.

24 Στα κύτταρα ελέγχου (a), σ’ αυτά με SGPL1 siRNA (b), και στα κύτταρα με κωδικοποιημένο siRNA (c) :

25 Κύτταρα που έλαβαν 10 nΜ TG φαίνονται στις εικόνες d και j
Κύτταρα που έλαβαν 10 nΜ TG φαίνονται στις εικόνες d και j. Τα 10nM TG μειώνουν τη χρώση δεσμοπλακίνης στα σύνορα των κυττάρων μετά από 3 ώρες (d) , ενώ η ενδοκυττάρια διατήρηση της δεσμοπλακίνης είναι εμφανής μετά από 48ώρες, αλλά παρατηρούνται κενά μεταξύ των κυττάρων(j).

26 Control (Εικόνα e και k): Η προσθήκη siRNA στο SGPL1 προκαλεί την αναστολή της και βελτιώνει τον εντοπισμό της δεσμοπλακίνης στις 3 ώρες (e), αλλά η πλήρης εξομάλυνση του εντοπισμού της δεσμοπλακίνης φαίνεται μόνο στις 48ώρες (k).

27 Control T10 (Εικόνες c, f, i kai l): Η προσθήκη κωδικοποιημένου siRNA δε βελτίωσε τον ανώμαλο εντοπισμό της δεσμοπλακίνης και δεν είχε καμία επίδραση.

28 Συμπερασματικά, οι δυσκολίες στον εντοπισμό της δεσμοπλακίνης που προκαλούνται από την αδρανοποίηση της SERCA2 από την TG εξομαλύνονται με την αναστολή της SGPL1.

29 Μετρήσεις ασβεστίου ενδοπλασματικού δικτύου
Χρησιμοποιήσαμε αισθητήρα D1ER ενδοπλασματικού δικτύου που στοχεύει στα ιόντα ασβεστίου για την παρακολούθηση της εξάντλησης τους. Οι μετρήσεις καταγράφηκαν με διπλά κανάλια φθορισμού 24ώρες αργότερα χρησιμοποιώντας ένα Zeiss LSM Meta ομοεστιακό σύστημα.

30 Φυσιολογικά ανθρώπινα κερατινοκύτταρα ήταν επιμολυσμένα με τον αισθητήρα D1ER . Τα κύτταρα δέχτηκαν επίσης siRNA για πρόκληση αναστολής της SGPL1 ή κωδικοποιημένο siRNA σαν δείγμα ελέγχου. Μετά από 8ώρες, τα κύτταρα έλαβαν 10 nM TG για 2 ώρες και επωάζονται με πολύ ασβέστιο για επιπλέον 24 ώρες. (a) Μέσος δείκτης της Fo¨ rster απήχησης της μεταφοράς ενέργειας (b) μέση συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου ενδοπλασματικού δικτύου (c) σχετικές αλλαγές ιόντων ασβεστίου μεταξύ των κυττάρων ελέγχου και των κατεργασμένων με TG.

31 Εικόνα a: Η μείωση του δείκτη της Fo¨rster απήχησης δείχνει χαμηλότερες συγκεντρώσεις ιόντων ασβεστίου. Οι αναλογίες Fo¨rster απήχησης μεταφοράς ενέργειας μετατράπηκαν σε συγκέντρωση ασβεστίου. Εικόνα a και b: Τα 10 nΜ TG προκάλεσαν σημαντική πτώση της συγκέντρωσης ασβεστίου και σε ακατέργαστα δείγματα και σε αυτά που έλαβαν κωδικοποιημένο siRNA. Ωστόσο, τα 10 nΜ TG δεν είχαν σημαντική επίδραση στα ιόντα ασβεστίου σε κύτταρα επεξεργασμένα με SGPL1 siRNA.

32 Εικόνα c: Η προσθήκη TG προκαλεί πτώση περισσότερο από 50% στη συγκέντρωση ιόντων ασβεστίου ενδοπλασματικού δικτύου σε τόσο ανεπεξέργαστα κερατινοκύτταρα και κερατινοκύτταρα με κωδικοποιημένο siRNA. Σε αντίθεση, η αναστολή της SGPL1 εμπόδισε τη δράση της TG που προκαλεί αυτή την απώλεια ιόντων ασβεστίου.

33 Άρα τα ελαττώματα στη δέσμευση ιόντων ασβεστίου ενδοπλασματικού δικτύου που προκαλούνται από την αναστολή της SERCA2 εξομαλύνονται με την αναστολή της SGPL1. Η αναστολή της SGPL1 δεν άλλαξε τα πρωτεϊνικά επίπεδα της SERCA2 ή την έκφραση της SPHK1, γεγονός που υποδηλώνει ότι η αύξηση των ιόντων ασβεστίου προκλήθηκε από ένα μηχανισμό ανεξάρτητο της σύνθεση της SPHK1 ή της SERCA2.

34 Συμπέρασμα Η SGPL1 απευθύνεται ως ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για την ασθένεια του Darier. Η αναστολή της SGPL1 βελτιώνει τον εντοπισμό της δεσμοπλακίνης, η οποία έχει εμπλακεί στην ασθένεια του Darier και «σώζει» την εξάντληση των ιόντων ασβεστίου που προκαλεί ανωμαλίες στη διαφοροποίηση και στην προσκόλληση των κερατινοκυττάρων και αποκαθιστά τις αποθήκες ιόντων ασβεστίου που έχουν εξαντληθεί από την αναστολή της SERCA2.

35 Η αδρανοποίηση της SERCA2b αναστέλλει την SPHK1, οδηγώντας σε αυξημένη ενδοκυτταρική σφιγγοσίνη και άρα στα προβλήματα που παρατηρούνται στην ασθένεια του Darier. Αναστρέφοντας την αναστολή της SERCA2 που προκαλείται από την προσθήκη TG ή siRNA βελτιώνονται τα ελαττώματα στους κόμβους και στη διαφοροποίηση που είναι γνωστό ότι διέπουν την παθολογία της ασθένειας του Darier.

36 Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι η αυξομείωση του σφιγγολιπιδικού μονοπατιού ίσως βελτιώσει την ελαττωματική προσκόλληση των κυττάρων που είναι το σήμα κατατεθέν της ασθένειας του Darier. Η εξωγενής S1P βρέθηκε αναποτελεσματική για τη βελτίωση των ελαττωμάτων στην προσκόλληση και στη διαφοροποίηση. Άρα η παραγωγή της ενδοκυττάριας S1P είναι απαραίτητη για να σώσει απ’ την ασθένεια του Darier.

37 Πηγές

38 Σας ευχαριστώ για την υπομονή σας…