Απόπτωση: Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος

Παρουσίαση με θέμα: "Απόπτωση: Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Απόπτωση: Προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος
Μορφολογική παρατήρηση και περιγραφή (Vogt, 1842) Ορολογία: απόπτωση = μη-νεκρωτικός κυτταρικός θάνατος (Kerr et al., 1972) ΚΑΡΑΓΚΟΥΝΗ ΕΥΔΟΚΙΑ, ΕΛΛΗΝΙΚΟ ΙΝΣΤΙΤΟΥΤΟ ΠΑΣΤΕΡ

2 Apoptosis - (Gr. "falling") a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R Br. J. Cancer 26:239. “We are most grateful to Prof. James Cormack of the Dept. of Greek, Univ. Aberdeen, for suggesting the term. The word “apoptosis” is used in Greek to describe the “dropping off” or “falling off” of petals from flowers or leaves from trees.”

3 Μεταμόρφωση αμφιβίων και απόπτωση
Παράδειγμα: Μεταμόρφωση γυρίνου σε βάτραχο. Οι μηχανισμοί της απόπτωσης ενεργοποιούνται δια μέσου ορμονικών μηνυμάτων πχ θυροειδικών ορμονών, εκδυσόνης κλπ.

4 Εμβρυονική ανάπτυξη και απόπτωση
Παράδειγμα: Ανάπτυξη εμβρυονικού άκρου ποντικού. Τα κύτταρα που διάγουν απόπτωση είναι σημασμένα με φθορίζουσα χρωστική.

5 Σημασία της απόπτωσης Παίζει σημαντικό ρόλο στην: εμβρυονική ανάπτυξη
διατήρηση ιστικής ομοιόστασης γήρανση λειτουργία του νευρικού συστήματος δημιουργία και διατήρηση του λεμφοκυτταρικού ρεπερτορίου άμυνα εναντίον παθογόνων μικροοργανισμών

6 Σημασία της απόπτωσης Απόπτωση=σημαντική λειτουργία της ίδιας της ζωής
Περιέχεται στην παθογένεια πολλών ασθενειών: Νευροεκφυλιστικές ασθένειες - Parkinson - Alzheimer - Μυϊκή ατροφία Καρκίνος Αυτοάνοσες ασθένειες (Διαβήτης τύπου Ι) Απόπτωση=σημαντική λειτουργία της ίδιας της ζωής Απόπτωση > φυσιολογικής Απόπτωση < φυσιολογικής

7 Χαρακτηριστικά κυττάρων που αποπίπτουν
Συρρίκνωση του κυττάρου Απώλεια μεμβρανικής ασυμμετρίας Έκθεση φωσφατιδυλοσερίνης Ρήξη του μιτοχονδρίου και απελευθέρωση του κυτοχρώματος c Συμπύκνωση της χρωματίνης Κατάτμηση του DNA Θρυμματισμός του πυρήνα Δημιουργία αποπτωτικών σωματιδίων Κύτταρα τροφοβλάστης που διάγουν απόπτωση

8 Διαφορές μεταξύ νέκρωσης και απόπτωσης

9 Διαφορές μεταξύ νέκρωσης (Α) και απόπτωσης (Β & C)

10 Τελικό στάδιο απόπτωσης

11 Φαγοκυττάρωση αποπτωτικών κυττάρων
Phagocyte Apoptotic Cell / body RAC-1 DOCK 180 CRKII ELMO Cytoskeletal Reorganization for Engulfment C1q Receptor Bridge C1q C1q Binding Site PS Phosphatidylo- serine Receptors Scavenger Receptors ? Υποδοχείς φωσφατιδυλοσερίνης (PS) Υποδοχείς εκκαθάρισης/αποικοδόμησης C1q υποδοχέας

12 Προϋποθέσεις απόπτωσης
Mείωση των θετικών σημάτων Στέρηση των κυττάρων από Αυξητικούς παράγοντες και Προϊόντα θρέψης Αύξηση των αρνητικών σημάτων Παράδειγμα: Ανάπτυξη νευρώνων Με την απόπτωση ρυθμίζεται μόνο η ανάπτυξη των νευρικών κυττάρων που συνδέονται με τα κύτταρα στόχους

13 Προϋποθέσεις απόπτωσης
Mείωση των θετικών σημάτων Στέρηση των κυττάρων από Αυξητικούς παράγοντες και Προϊόντα θρέψης Αύξηση των αρνητικών σημάτων Βλάβες του DNA εξαιτίας έκθεσης των κυττάρων σε: Οξειδωτικές ουσίες Υπεριώδη ακτινοβολία Ακτίνες Χ Χημειοθεραπευτικά σκευάσματα Συγκέντρωση πρωτεϊνών με ακατάλληλη τεταρτοταγή δομή Ενεργοποίηση δια μέσου ειδικών μεμβρανικών συμπλεγμάτων Υποδοχείς θανάτου (death receptors) και Προσδέματα θανάτου (death ligands)

14 Προϋποθέσεις απόπτωσης

15 Press Release: The 2002 Nobel Prize in Physiology or Medicine
7 October 2002 The Nobel Assembly at Karolinska Institute has today decided to award The Nobel Prize in Physiology or Medicine for 2002 jointly to Sydney Brenner, H. Robert Horvitz and John E. Sulston for their discoveries concerning "genetic regulation of organ development and programmed cell death" C. elegans Ανάπτυξη ΕGL-1 CΕD-9 CΕD-4 CED-3 Κυτταρικός θάνατος 1927 1947 1942

16

17 1. Απόπτωση που ενεργοποιείται από εξωγενή κυτταρικά μηνύματα:
Μονοπάτια απόπτωσης 1. Απόπτωση που ενεργοποιείται από εξωγενή κυτταρικά μηνύματα: Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου 2. Απόπτωση που ενεργοποιείται από ενδογενή κυτταρικά μηνύματα: Μιτοχονδριακό μονοπάτι

18 Διαφορές μεταξύ των μονοπατιών απόπτωσης
Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου Καθοδηγούμενη απόπτωση Δεν απαιτείται πρωτεϊνική σύνθεση (αναστολή της πρωτεϊνικής σύνθεσης επιταχύνει την απόπτωση) Πολύ γρήγορος κυτταρικός θάνατος – μέσα σε λίγες ώρες Μιτοχονδριακό Προεπιλεγμένο μονοπάτι Ενεργοποιείται σε συνθήκες κυτταρικού stress Απαιτείται πρωτεϊνική σύνθεση Χρειάζονται h για την ολοκλήρωσή του

19 (Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου)
Μόρια που συμμετέχουν στην επαγωγή απόπτωσης δια μέσου εξωγενών μηνυμάτων (Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου) Υποδοχείς θανάτου Προσδέματα θανάτου Σηματοδοτικά μόρια που συνδέονται στο ενδοκυτταροπλασματικό μέρος των υποδοχέων θανάτου Κασπάσες

20 Τι είναι οι υποδοχείς κυτταρικoύ θανάτου;
Διαμεμβρανικές πρωτεΐνες τύπου Ι TNF-RΙ, CD95 (Fas ή APO-1, 1989) Εξωκυτταρικό τμήμα χαρακτηρίζεται από την ύπαρξη 24 συντηρημένων μοτίβων κυστεϊνης (CCCC) Ενδοκυτταρικό τμήμα φέρει περιοχές θανάτου (Death Domain, DD) Eνεργοποιούνται με ειδικά mAbs Yπό Φ.Σ. ενεργοποιούνται με φυσικά προσδέματα (πχ CD95L, TNF) Απαιτείται ολιγομερισμός Περισσότεροι του ενός υποδοχείς δεσμεύουν το ίδιο πρόσδεμα

21 Ενδοκυτταροπλασματικές περιοχές θανάτου (Death Domain, DD)
Συντηρημένες αλληλουχίες στην κυτταροπλασματική περιοχή των υποδοχέων κυτταρικού θανάτου Πειραματικά δεδομένα Απαλοιφή των 15 αμινοξέων του C-άκρου του CD95  αύξηση της απόπτωσης Απαλοιφή > 15 αμινοξέων  πλήρης απώλεια αποπτωτικού σήματος Υπεύθυνες για τη μεταγωγή μηνυμάτων κυτταρικού θανάτου Αλληλεπιδρούν με ενδοκυτταροπλασματικές πρωτεϊνες που φέρουν συμπληρωματικές αλληλουχίες (πχ FADD μόριο)

22 Ενδοκυτταροπλασματικές περιοχές θανάτου (Death Domain, DD)
Παράδειγμα: Ενδοκυτταροπλασματική περιοχή θανάτου του Fas μορίου → 127 αμινοξέα, 6 αντιπαράλληλες, αμφιπαθικές α-έλικες DD του TNF-RI  80 αμινοξέα Μετάλλαξη στη θέση Val238 στο DD του CD95  Πειραματικό αυτοάνοσο λεμφοβλαστικό σύνδρομο (lpreg)

23 Ολιγομερισμός του CD95 υποδοχέα
Πειραματικά δεδομένα Αντι-CD95 αντισώματα επάγουν σήματα απόπτωσης ανάλογα με τον ισότυπό τους και με την ακόλουθη σειρά IgG3>>IgG1>IgG2a>IgG2b (=μηδενική) Η καταλληλότερη δομή για την έναρξη αποπτωτικής διαδικασίας είναι η τριμερής μορφή του CD95 υποδοχέα Κρυσταλλογραφική μελέτη του συμπλέγματος απεκάλυψε ανάλογη διαμόρφωση και για τους TNF-R

24 Οικογένεια υποδοχέων κυτταρικoύ θανάτου
Υποδοχέας Απόπτωση ________________________________________________________ CD95 (ΑΡΟ-1/Fas) + DR4/TRAIL-R1 + DR5/TRAIL-R2/TRICK2 + TRAIL-R3/DcR1/TRiD - TRAIL-R4/DcR2/LiT - OPG DR3/wsl-1/APO-3/TRAMP/LARD + CAR TNF-RI (CD120a) + TNF-RII (CD120b) + LTβ-R CD40, CD30, CD _________________________________________________________

25 Τι είναι τα προσδέματα κυτταρικoύ θανάτου;
Διαμεμβρανικές πρωτεΐνες τύπου ΙΙ που χαρακτηρίζονται από δομές β-πτύχωσης Εξαίρεση αποτελεί η LTβ Ανήκουν στην οικογένεια του TNF Υφίστανται και σε διαλυτή μορφή (μετά από δράση μεταλλοπρωτεασών) Διαλυτή μορφή = βιολογικά ενεργή LTβ

26 Οικογένεια προσδεμάτων κυτταρικoύ θανάτου
Οικογένεια ΤΝF Πρόσδεμα Υποδοχέας ____________________________________________ CD95L CD95 TRAIL (APO-2L) TRAIL-R1-4, OPG TRANCE (RANKL/OPGL) OPG TNFα TNF-RI, TNF-RII ΤΝFβ/LTα TNF-RI, TNF-RII LTβ LTβ-R CD40L (TRAP/gp39) CD40 CD30L CD30 CD27 L (CD70) CD27 4-1BBL BB OX-40L (gp34) OX-40 __________________________________________________

27 (Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου)
Μόρια που συμμετέχουν στην επαγωγή απόπτωσης δια μέσου εξωγενών μηνυμάτων (Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου) Υποδοχείς θανάτου Προσδέματα θανάτου Σηματοδοτικά μόρια που συνδέονται στο ενδοκυτταροπλασματικό μέρος των υποδοχέων θανάτου Κασπάσες

28 Τι είναι τα σηματοδοτικά μόρια που συνδέονται στους υποδοχείς θανάτου;
Κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες που φέρουν 2 συντηρημένες αλληλουχίες π.χ. FADD μόριο που συνδέεται στο DD του CD95 υποδοχέα Death Domain, DD και Death Effector Domain, DED Όπου προσδένονται οι κασπάσες

29 Οικογένεια σηματοδοτικών μορίων που συνδέονται στους υποδοχείς θανάτου
Σηματοδοτικό μόριο DΕD Απoπτωτικό σήμα FADD (MORT1) +  RIP  TRADD   DAXX  FAF  UBC-FAP (UBC9) -  FAP  Sentrin  _________________________________________________ Επίσης, ρυθμιστικός ρόλος αποδίδεται και στα 15 τελευταία αμινοξέα του C-άκρου του CD95 όπου συνδέεται το FAP 1

30 Τι είναι οι κασπάσες ; Cytosolic (ή Cysteine-dependent) Aspartate-Specific Proteases (CASPases)
Είναι πρωτεάσες της κυστεΐνης, κόβουν μετά από κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος Κατεξοχήν εκτελεστές της απόπτωσης – στη δράση των κασπασών οφείλονται οι περισσότερες από τις μορφολογικές αλλαγές που παρατηρούνται στα κύτταρα που αποπίπτουν Η οικογένεια των κασπασών περιλαμβάνει 14 τουλάχιστον μέλη (Μεγάλη ομολογία – Υψηλά συντηρημένη) Με βάση τη λειτουργία τους κατατάσσονται σε 3 υπο-οικογένειες 1. Κασπάσες που ενεργοποιούνται στη φλεγμονή (-1, -4, -5, -11, -12, -13, -14 2. CED-3-like ή κασπάσες έναρξης (-2, -8, -9, -10) 3. Κασπάσες δράσης (-3,-6, -7)

31 Οικογένεια των κασπασών
Caspase Recruitment Domains (CARD) Death Effector Domains (DED)

32 Ενεργοποίηση κασπασών
Υφίστανται σαν προένζυμα και τα μόριά τους αποτελούνται από τρεις περιοχές: Ενεργοποιούνται μετά από πρωτεόλυση των μορίων σε θέσεις μεταξύ των περιοχών p20 και p10 και pro και p20

33 Ενεργοποίηση κασπασών
Η πρωτεόλυση των προενζύμων των κασπασών δίνει γένεση στο ενεργό μόριο που είναι ένα ετεροτετραμερές σύμπλεγμα με δύο ενεργά κέντρα Asp-X θέσεις Ενεργοποιούνται από διάφορα αποπτωτικά μηνύματα Αυτό το μοντέλο ενεργοποίησης ανταποκρίνεται ικανοποιητικά για την ενεργοποίηση των κασπασών -3, -6 και -7

34 Άλλα μοντέλα ενεργοποίησης κασπασών
Η ενεργοποίηση των κασπασών οφείλεται στην αυξημένη συγκέντρωση των μορίων τους και κατευθύνεται από τα σηματοδοτικά μόρια Αυτό το μοντέλο ενεργοποίησης ανταποκρίνεται ικανοποιητικά για την ενεργοποίηση της κασπάσης -8 Οι κασπάσες-8, -10 θεωρούνται κασπάσες έναρξης, ενώ παραμένει άγνωστη η σειρά ενεργοποίησής τους Το μοντέλο αυτό καλύπτει και την ενεργοποίηση της κασπάσης -2

35 Άλλα μοντέλα ενεργοποίησης κασπασών
Σχηματισμός αλλοενζύμου - Ενεργοποίηση κασπάσης-9 Στο σχηματισμό του ενεργού ενζύμου συμμετέχουν δύο ακόμη μόρια, ο παράγοντας Apaf-1 και το κυτόχρωμα C που απελευθερώνεται από τα μιτοχόνδρια

36 Ενεργοποίηση κασπάσης-9
Η πρωτεόλυση δεν παίζει σημαντικό ρόλο Ο Apaf-1 ολιγομερίζεται με τη βοήθεια του ATP και του κυτοχρώματος C Τα μόρια της προκασπάσης-9 συνδέονται στο αποπτώσωμα Οι διαμορφωτικές μεταβολές που υφίστανται τα μόρια της προκασπάσης-9, κατά τη σύνδεσή τους στο αποπτώσωμα συμβάλλουν στην ενεργοποίηση του ενζύμου Η κασπάση-9 θεωρείται επίσης κασπάση έναρξης

37 Μοριακοί στόχοι κασπασών
Δρουν σε διάφορους στόχους μεταξύ των οποίων περιέχονται λειτουργικά και δομικά συστατικά του κυττάρου, για παράδειγμα: Lamin A – βασικό συστατικό για τη δομή του πυρήνα PARP (πολυ(ADP-ριβόζη) πολυμεράση, ένζυμο που συμμετέχει στο μηχανισμό επιδιόρθωσης του DNA U1-70kd – παράγοντας που συμμετέχει στο splicing DNA-PK – ένζυμο που συμμετέχει στο μηχανισμό επιδιόρθωσης του DNA και στη σηματοδότηση των Toll-like υποδοχέων Rb – παράγοντας καταστολής όγκων, ρυθμιστικός παράγοντας του κυτταρικού κύκλου H1 histone – βασική πρωτεΐνη για την οργάνωση της χρωματίνης CAD – (Caspase Activated) DNAση που ενεργοποιείται από τη δράση κασπασών, υπεύθυνη για την κατάτμηση του DNA στα κύτταρα που αποπίπτουν

38 Κατάτμηση του DNA Αποκοπή της ανασταλτικής υπομονάδας ICAD
Κατάτμηση του γενωμικού DNA μεταξύ των νουκλεοσωμάτων (180bp) Normal cell Apoptotic cell Apoptotic cell JIANG et al., Cell Research (2000), 10,

39 CD95/CD95L σύμπλεγμα ΙΙ) CD95/Fas πρόσδεμα
Διαμεμβρανικό μόριο που κλωνοποιήθηκε από ΝΚ κύτταρα Σε υπερκείμενα καλλιέργειας COS κυττάρων, που υπερεκφράζουν το CD95L, βρέθηκε δραστική διαλυτή μορφή του CD95L Το γονίδιο του ανθρώπου και του ποντικού για το CD95L εντοπίσθηκε στο 1 χρωμόσωμα Εκφράζεται αποκλειστικά μετά από ενεργοποίηση σε ώριμα CD4+ και CD8+ T κύτταρα Η διαλυτή μορφή του CD95L είναι τριμερής και λαμβάνεται μετά από ενζυμική δράση μεταλλοπρωτεασών Ι) Υποδοχέας CD95/APO-1/Fas Γλυκοσυλιωμένος διαμεμβρανικός υποδοχέας τύπου Ι που απαντάται και σε διαλυτή μορφή (335 αμινοξέa, kDa) Το ανθρώπινο γονίδιο για τον CD95 ονομάζεται ΑΡΤ, και εδράζει στο 10q23 χρωμόσωμα Εκφράζεται σε διάφορα κύτταρα, όπως επιθηλιακά και αιμοποιητικά Η έκφραση του στα Β και Τ κύτταρα ενισχύεται με κυτοκίνες (IFNγ και ΤΝF) και αντιγόνα Απόπτωση δια μέσου του CD95 υποδοχέα επιτυγχάνεται με ειδικά mΑbs και του φυσικού του προσδέματος

40 Επαγωγή προ- ή αντι-αποπτωτικών μηνυμάτων από τους TNFRΙ και DR3
Στους TNFRΙ και DR3 η σύνδεση του FADD προϋποθέτει τη μεσολάβηση του TRADD → απόπτωση O TRADD μπορεί όμως να επιτρέψει και τη σύνδεση των RIP και TRAF2 → επιβίωση (ενεργοποίηση των NF-κΒ και ΑΡ-1 δια μέσου των ΜΑΡ κινασών)

41 Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου
(πχ CD95/CD95L)

42 Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου

43 Μονοπάτια απόπτωσης 1. Απόπτωση που ενεργοποιείται από εξωγενή κυτταρικά μηνύματα: Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου 2. Απόπτωση που ενεργοποιείται από ενδογενή κυτταρικά μηνύματα: Μιτοχονδριακό μονοπάτι

44 Στοιχεία του μιτοχονδριακού μονοπατιού
Μιτοχόνδρια Αποπτώσωμα (Apaf-1, ΑΤP, κυτόχρωμα C, κασπάση-9) Κασπάσες δράσης Οικογένεια Bcl-2 πρωτεϊνών

45 Τι είναι οι Bcl-2 πρωτεϊνες;
Προσδιορίσθηκαν για πρώτη φορά σε Β-λέμφωμα Αργότερα διαπιστώθηκε η ύπαρξή τους σε φυσιολογικά κύτταρα Σχηματίζουν ομοδιμερή ή ετεροδιμερή συμπλέγματα και ο ρόλος τους είναι η ρύθμιση της απόπτωσης Bcl-2 αλληλεπιδρά με την Bax-α πρωτεΐνη, που υπερεκφράζεται στο κυτταρόπλασμα κυττάρων που αποπίπτουν  ο έλεγχος της απόπτωσης Βcl-xL  παρεμποδίζει την απόπτωση (όπως και η Bcl-2) Bcl-xS  ανταγωνίζεται τη δράση της Bcl-2 Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk Ιϊκές πρωτεΐνες με μεγάλη ομολογία με τις Bcl-2 πρωτεΐνες παρεμποδίζουν την απόπτωση των μολυσμένων κυττάρων

46 Οικογένεια των Bcl-2 πρωτεϊνών

47 Τρόπος δράσης των Bcl-2 πρωτεϊνών
Cell death stimuli Anti-apoptotic Bcl-2 Pro-apoptotic Bad Κυτόχρωμα c

48 Μοντέλα δράσης των Bcl-2 πρωτεϊνών

49 Ισορροπία μεταξύ προ- και αντι-αποπτωτικών
πρωτεϊνών της οικογένειας Bcl-2

50 Ρόλος της Bcl-2 πρωτεΐνης
Ακτινοβολία  βλάβες του DNA δράση γλυκοκορτικοειδών  sοdium azide Cα  ρίζες Ο 2- θερμοπληξία Δεν ασκεί προστατευτική δράση στα: αρνητική επιλογή θυμοκυττάρων κυτταρικό θάνατο που προκαλείται από δράση TNF λύση κυττάρου-στόχου από κυτταροτοξικό Τ-κύτταρο

51 Μιτοχονδριακό μονοπάτι

52 Μιτοχονδριακό μονοπάτι Μονοπάτι υποδοχέων θανάτου

53 Αναστολείς της απόπτωσης
FLIPs: Προσδιορίσθηκαν για πρώτη φορά σε κύτταρα μολυσμένα με ιούς Ονομάσθηκαν vFLIPs (viral FLICE inhibitory proteins) Xαρακτηρίζoνται από την ύπαρξη δύο DED Προσδένονται στο CD95R/FADD σύμπλεγμα Εμποδίζουν το λειτουργικό σχηματισμό του DISC και την έναρξη του καταρράκτη των κασπασών Ανθρώπινο ομόλογο του vFLIP  cFLIP Aπαντάται σε δύο ισομορφές Το γονίδιό του εδράζει στο 2 χρωμόσωμα και έχει μέγεθος 200 αμινοξέα IΑPs: Εμποδίζουν την έναρξη του καταρράκτη των κασπασών-δράσης (κασπάση 3-7). Η λειτουργία τους παρεμποδίζεται από Smac/DIABLO. Στόχος η παρεμπόδιση/ακύρωση μεταγωγής αποπτωτικού μηνύματος

54

55 Σύνοψη αποπτωτικών μηνυμάτων

56 Απόπτωση στο ανοσολογικό σύστημα
Απόπτωση στο ανοσολογικό σύστημα Σε ένα φυσιολογικό ανοσολογικό σύστημα απόπτωση συμβαίνει: στο μυελό των οστών και το θύμο αδένα  απομάκρυνση αυτοδραστικών Β και Τ κυττάρων στα πρωτογενή λεμφικά όργανα  απομάκρυνση λεμφοκυττάρων με ανώμαλη αναδιάταξη γονιδίων που ορίζουν μη-λειτουργικούς αντιγονικούς υποδοχείς (ανοσοσφαιρινικός υποδοχέας – Β κύτταρα, TCR –Τ κύτταρα) στους λεμφαδένες και το σπλήνα  επιλογή των πλέον ειδικών Β και Τ κυττάρων με στόχο την επιτυχία των ανοσολογικών αποκρίσεων στους περιφερικούς ιστούς  έκφραση κυτταροτοξικότητας δια μέσου CD8+ κυττάρων Τα κύτταρα που επιβιώνουν από τη διαδικασία της απόπτωσης αποτελούν τα μνημονικά κύτταρα

57 Κεντρική απόπτωση στο μυελό των οστών κατά την
οντογένεση των Β κυττάρων B Ρυθμίζεται η δόμηση του ανοσοσφαιρινικού υποδοχέα Επιβεβαιώνεται ότι κάθε κύτταρο φέρει υποδοχείς μιας μόνο ειδικότητας B Ελέγχονται και καταστρέφονται τα αυτοδραστικά Β λεμφοκύτταρα B Εξάγονται τα σωστά κύτταρα στη περιφέρεια B Παράγονται τα αντισώματα B Στο μυελό των οστών αποπίπτουν όλα τα Β κύτταρα που δεν έχουν επιτύχει σωστή αναδιάταξη του ανοσοσφαιρινικού υποδοχέα ή φέρουν υποδοχείς που αναγνωρίζουν «εαυτά» αντιγόνα

58 Ανοσοσφαιρινικός υποδοχέας
Ελαφριές αλυσίδες Μεταβλητή περιοχή VL L CL VH CH1 H CH2 Δισουλφιδικός δεσμός CH3 Βαριές αλυσίδες Σταθερή περιοχή Δύο ισότυποι ελαφριών αλυσίδων: κ και λ (≈24kDa) Πέντε ισότυποι βαριών αλυσίδων: γ, α, μ, δ και ε (50-70 kDa) Πέντε τάξεις ανοσοσφαιρινών IgG, IgA, IgM, IgD και IgE Τέσσερις υποτάξεις ΙgG ΙgG1, ΙgG2, ΙgG3 και ΙgG4 Δύο υποτάξεις IgA IgA1 και IgA2

59 Ανεπιτυχής αναδιάταξη των Η και L γονιδίων οδηγεί σε απόπτωση τα ανώριμα Β κύτταρα
Μεγάλο προ-B Μικρό DNA αλληλουχία Η αλυσίδας V D J C V C D J D J DH-JH ανασυνδιασμός V C D J V VH-DHJH ανασυνδυασμός Η αλυσίδα: 1/9 η πιθανότητα επιτυχούς ανασυνδυασμού DNA αλληλουχία L αλυσίδας V J C V C J V VL-JL ανασυνδυασμός L αλυσίδα: 1/3 η πιθανότητα επιτυχούς ανασυνδυασμού Ig μόριο: 1/27 η πιθανότητα σωστού μορίου Ανεπιτυχείς αναδιατάξεις εμποδίζουν την περαιτέρω ωρίμανση και επιβάλλουν την απόπτωση των ανώριμων Β κυττάρων

60 Απόπτωση των Β κυττάρων που αναγνωρίζουν «εαυτά» αντιγόνα κατά την κλωνική απαλοιφή
B B Ανώριμο Ανώριμο B κύτταρο αναγνωρίζει ΠΟΛΥΣΘΕΝΕΣ «εαυτό» αντιγόνο Y Κλωνική απαλοιφή με απόπτωση

61 Στο θύμο αδένα αποπίπτουν όλα τα Τ κύτταρα με ανεπιτυχή αναδιάταξη του TcR
Φλοιός Ανώριμα διπλά αρνητικά & θετικά θυμοκύτταρα Μυελός Ώριμα μονά ΔΑ CD25- CD44+ ΔΑ CD25+ CD44+ ΔΑ CD25+, CD44 ΔΑ CD3+ προ-Tα:β CD25-, CD44- ΔΘ CD3+ προ-Tα:β ΔΘ CD3+ TcRαβ+ ΜΘ CD3+ TcRαβ+ CD8+ CD4+

62 Αντιγονικός υποδοχέας Τ κυττάρων (TcR)

63 Ανεπιτυχής αναδιάταξη των γονιδίων των α και β αλυσίδων του ΤcR οδηγεί σε απόπτωση τα ανώριμα
Τ κύτταρα L Vα1 L Vαn L Vδ1 L Vδn Dδ1Dδ2Jδ1Jδ2 Cδ L Vδ5 Jα1Jα2 Jαn Cα 14ο χρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος α αλυσίδας TcR L Vα1 L Vα2 L VαJα Jαn Cα DNA αναδιάταξη α αλυσίδας VαJαCα Πρωτεϊνικό προϊόν αβ ετεροδιμερές T κύτταρο VβDβJβCβ L Vβ1 LVβDβJβ Cβ Dβ Jβ Cβ2 L Vβ14 DNA αναδιάταξη β αλυσίδας L Vβ L Vβn Dβ Jβ Cβ1 Dβ Jβ Cβ2 L Vβ14 7ο χρωμόσωμα Γονιδιακός τόπος β αλυσίδας TcR

64 Θετική επιλογή Αρνητική επιλογή Διατήρηση των θυμοκυττάρων που φέρουν TcRs που αναγνωρίζουν αντιγόνα σε συνδυασμό με «εαυτά» MHC μόρια Απομάκρυνση των θυμοκυττάρων που φέρουν TCRs που αναγνωρίζουν «εαυτά» αντιγόνα

65 Στο θύμο αποπίπτουν τα επιβλαβή και άχρηστα
Τ κύτταρα Y T Αντιγονικό ρεπερτόριο του υποδοχέα ενός πληθυσμού Τ κυττάρων ΘΥΜΟΣ Y T Y T ? Y T APC Επιβλαβή Άχρηστα Χρήσιμα Αρνητική επιλογή Θετική επιλογή Απόρριψη

66 Τα περισσότερα από τα Τ κύτταρα που ωριμάζουν στο θύμο πεθαίνουν εκεί!
Θύμος ποντικού 5 x 107 ημερησίως 1-2 x 108 κύτταρα 2 x 106 ημερησίως 98% των Τ κυττάρων πεθαίνουν στο θύμο χωρίς να προκληθεί καμία αντίδραση φλεγμονής ή να αλλάξει το μέγεθός του Τα θυμικά μακροφάγα φαγοκυτταρώνουν τα θυμοκύτταρα που αποπίπτουν

67 Στο θύμο επιλέγονται Τ κύτταρα που φέρουν TcR με μέτρια χημική συγγένεια για τα «εαυτά» MHC μόρια και αντιγόνα Άχρηστα Αποπίπτουν Χρήσιμα Θετική επιλογή Επιβλαβή Αρνητική επιλογή Αριθμός θυμοκυττάρων που αποπίπτουν Χαμηλή Υψηλή Χημική συγγένεια της αλληλεπίδρασης των TcR/MHC

68 Στα περιφερικά λεμφικά όργανα τα Β κύτταρα συναντούν τα αντιγόνα των μικροοργανισμών
Τα B κύτταρα αφήνουν την κυκλοφορία του αίματος και εισέρχονται στο λεμφαδένα Τα B κύτταρα πολλαπλασιάζονται ταχύτατα Τα αντιγόνα συναθροίζονται στο λεμφαδένα από τα προσαγωγά λεμφαγγεία Y Από τα βλαστικά κέντρα απελευθερώνονται B κύτταρα που διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα και Β κύτταρα μνήμης ΒΛΑΣΤΙΚΑ ΚΕΝΤΡΑ Περιοχές λεμφοζιδίων με έντονο πολλαπλασιασμό Β κυττάρων

69 Περιφερική απόπτωση Β κυττάρων στα βλαστικά κέντρα
Primary Follicles become secondary follicles when germinal centres develop Περιφερική απόπτωση Β κυττάρων στα βλαστικά κέντρα 2. Τα B κύτταρα λαμβάνοντας συνδιεγερτικά μηνύματα από τα DCs και τα Τ κύτταρα διαφοροποιούνται σε πλασματοκύτταρα και κύτταρα μνήμης 4. Πλασματοκύτταρα και Β κύτταρα μνήμης εγκαταλείπουν τον λεμφαδένα προς τους ιστούς της ανοσολογικής απόκρισης T Δενδριτικά κύτταρα (παρουσιάζουν αντιγόνα στα Β κύτταρα που φέρουν Ig υποδοχείς υψηλής συγγένειας) και CD4+ T κύτταρα (ενισχύουν τη διαφοροποίηση των Β κυττάρων και το σχηματισμό των κυττάρων μνήμης) B 3. Απόπτωση 1. B κύτταρο που έχει έρθει σε επαφή με το αντιγόνο (καταστέλλει την έκφραση των επιφανειακών Ig, πολλαπλασιάζεται και προβαίνει σε σωματικές υπερμεταλλάξεις σημείου των V γονιδίων των Ig με στόχο την ΩΡΙΜΑΝΣΗ ΣΥΓΓΕΝΕΙΑΣ των Ιg)

70 Απόπτωση κατά την ωρίμανση χημικής συγγένειας
Πέντε αντιγονικοί υποδοχείς Β κυττάρων είναι ειδικοί για αντιγόνο, αλλά με διαφορετική συγγένεια εξαιτίας μεταλλάξεων σημείου που έχουν συμβεί στη V περιοχή των Ig γονιδίων μέσα στα βλαστικά κέντρα B Μόνο αυτό το Β κύτταρο, που φέρει υποδοχέα που συνδέει το συγκεκριμένο αντιγόνο με μεγάλη δύναμη σύνδεσης, μπορεί να εκφράσει στην επιφάνειά του το CD40 μόριο και να λάβει 2ο συνδιεγερτικό μήνυμα από τα CD4+ T κύτταρα δια μέσου του CD40L και βέβαια να αποφύγει την απόπτωση εξαιτίας κλωνικής επιλογής. Τα άλλα κύτταρα αποπίπτουν.

71 Aπόπτωση T κυττάρων με τη συμμετοχή του ΤCR στην περιφέρεια
Έχει ως αποτέλεσμα την ανοχή με την απομάκρυνση των περιφερικών Β- και Τ-λεμφο-κυττάρων την καταστολή της ανοσολογικής απόκρισης την ανάπτυξη μνήμης Γίνεται με δύο τρόπους δια μέσου του CD95/CD95L συστήματος (CD4+) δια μέσου του TNF/TNF-RI συστήματος (CD8+) Τρόποι δράσης μεταξύ της ίδιας κατηγορίας κυττάρων (π.χ. μεταξύ Τ-κυττάρων) μεταξύ διαφορετικών κατηγοριών (π.χ. μεταξύ Β και Τ-κυττάρων) αυτοκτονία

72 Ενεργητική (μονοπάτι υποδοχέων θανάτου) και
παθητική ( μιτοχονδριακό μονοπάτι) απόπτωση Τ κυττάρων

73 Επαγωγή απόπτωσης σε κύτταρα-στόχους από
Τ κύτταρα που ασκούν κυτταρολυτική δράση Είναι CD8+ Τ κύτταρα που αναγνωρίζουν αντιγόνα που παρουσιάζονται με MHC μόρια τάξης I Αποστολή τους είναι να λύσουν κύτταρα-στόχους που έχουν μολυνθεί με ιούς ή βακτήρια Επίσης, συμμετέχουν στη λύση μεταμοσχευμένων και καρκινικών κυττάρων Λύνουν τα κύτταρα-στόχους διοχετεύοντας πρωτεολυτικά ένζυμα (όπως perforin, granzymes, granulosin) ή επάγοντας απόπτωση δια μέσου μεμβρανικών υποδοχέων Σε ορισμένες περιπτώσεις, λαμβάνουν βοήθεια από βοηθητικά CD4+ Τ κύτταρα (Th1).

74 Επαγωγή απόπτωσης δια μέσου perforin και granzyme
(CTLs και NK κύτταρα)

75 Τ κύτταρα που ασκούν κυτταρολυτική δράση
Χωρίς τη βοήθεια CD4+ T κυττάρων

76 κατά καρκινικού κυττάρου
Fas/FasL aπόπτωση και καρκινικό κύτταρο Ανοσολογική επίθεση κατά καρκινικού κυττάρου Αντεπίθεση καρκινικού κυττάρου Κυτταροτοξικό T κύτταρο / NK κύτταρο Απόπτωση FasL γονίδιο Ενεργοποίηση Υποδοχέας T κυττάρου ή υποδοχέας NK FasL Fas Fas MHC / αντιγόνο FasL FasL γονίδιο Απόπτωση Καρκινικό κύτταρο Καρκινικό κύτταρο Nagata, Nature Medicine 1996

77 Μηχανισμοί διαφυγής της απόπτωσης από τα καρκινικά κύτταρα
Μηχανισμοί διαφυγής της απόπτωσης από τα καρκινικά κύτταρα T κύτταρο FasL Fas Ομοιώματα διαλυτών Fas υποδοχέων Fas FasL FADD FLIP Καρκινικό κύτταρο κασπάση 8 Διαφυγή της απόπτωσης 1. c-FLIP: αλληλεπιδρά με το σηματοδοτικό μόριο, παρεμποδίζει την ενεργοποίηση της κασπάσης-8 και την απόπτωση 2. Πρωτεολυτική απομάκρυνση του FasL από την επιφάνεια του κυττάρου 3. Παραγωγή διαλυτών Fas ομοιωμάτων (DcR3) 4. Καταστολή της έκφρασης του Fas στα καρκινικά κύτταρα

78 Απόπτωση σε ανοσολογικά αποκλεισμένες περιοχές

79 Επαγωγή απόπτωσης από λευκοκύτταρα Υπερευαισθησία τύπου ΙΙ-
Κυτταροτοξικότητα μεσολαβούμενη από IgG (ADCC) Αν τα αντισώματα κατευθύνονται εναντίον επιφανειακών κυτταρικών αντιγόνων εκφράζεται κυτταροτοξικότητα Αυτοάνοσος αιμολυτική αναιμία

80 Απόπτωση και παθογόνα Απόπτωση = μηχανισμός άμυνας εναντίον ιών, βακτηρίων και παρασίτων κατά την έμφυτη και την επίκτητη ανοσία Τα παθογόνα έχουν αναπτύξει στρατηγικές τροποποίησης της απόπτωσης ώστε να εξασφαλίζουν τη διασπορά και την επιβίωσή τους

81 Απόπτωση και AIDS Ανοσολογικά χαρακτηριστικά του AIDS
To AIDS χαρακτηρίζεται από μειωμένο αριθμό CD4+ Τ λεμφοκυττάρων Όταν CD4+ Τ λεμφοκύτταρα < 200/μl aίματοςμεγάλος κίνδυνος από μολύνσεις Ο HIV μολύνει και σκοτώνει τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα, αλλά μόνο 1/ κύτταρα βρίσκονται μολυσμένα σους ασθενείς Πώς και γιατί μειώνονται τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα; Τα CD4+ Τ λεμφοκύτταρα αποπίπτουν με άγνωστους μηχανισμούς Μία πιθανότητα είναι: Έκφραση του Nef γονιδίου του ιού  αύξηση του FasL στη μεμβράνη των μολυσμένων κυττάρων Επαγωγή απόπτωσης των CD4+ Τ λεμφοκυττάρων

82 Toxoplasma gondii Επάγει ή παρεμποδίζει την απόπτωση ανάλογα με τη φάση της μόλυνσης Οξεία φάση: - απόπτωση CD4+ Τ κυττάρων δια μέσου του Fas/FasL - μη-απόκριση σε αντιγόνα και μιτογόνα - παρεμπόδιση ιστικών βλαβών Χρόνια φάση: - παρεμποδίζει την απόπτωση δια της επαγωγής του NF-kB - εξασφαλίζει πολλαπλασιασμό και επιβίωση In vitro μόλυνση: - εμποδίζει την απόπτωση

83 Leishmania spp BALB/c + L.donovani: - απόπτωση των CD4+
- DTH, IL-2 και IFNγ -  Th1 απόκριση Σπλαχνική λεϊσμανίαση: - απόπτωση των CD4+, CD8+ (L.braziliensis) In vitro μόλυνση: - παρεμπόδιση της απόπτωσης δια μέσου παραγωγής TNFα

84 Γονιδιακές ατέλειες που επηρεάζουν τους μηχανισμούς απόπτωσης
Γονιδιακές ατέλειες που επηρεάζουν τους μηχανισμούς απόπτωσης Σπάνιες ασθένειες  Αυτοάνοσο λεμφοβλαστικό σύνδρομο (ΑLPS) ετερόζυγη μετάλλαξη στο γονίδιο για το DD του CD95 Μεταλλάξεις στα γονίδια για το CD95Lκαι τις κασπάσες Εξέλιξη Συσσώρευση λεμφοκυττάρων στους λεμφαδένες και το σπλήνα Εμφάνιση αυτοάνοσων νοσημάτων όπως αιμολυτική αναιμία και θρομβοκυτταροπενία Πιθανή εμφάνιση λεμφώματος

85 Πειραματικά μοντέλα με γονιδιακές ατέλειες στους μηχανισμούς απόπτωσης
Πειραματικά μοντέλα ποντικών lpr μετάλλαξη: εισαγωγή μεταθετού στοιχείου στο CD95 γονίδιο μοντέλο SLE lpreg μετάλλαξη: μετάλλαξη σημείου στη DD του CD95 μοντέλο ΑLPS gld μετάλλαξη: μετάλλαξη σημείου στο C-άκρο του CD95L Αποτέλεσμα μεταλλάξεων Δυσλειτουργίες του ανοσολογικού συστήματος Λεμφαδενοπάθεια και αυτοανοσία Συσσώρευση Τ-λεμφοκυττάρων (Thy-1+, CD4-, CD8-, B220+) Υψηλοί τίτλοι αυτοαντισωμάτων

86 Ρύθμιση της απόπτωσης Η απόπτωση μπορεί να ρυθμιστεί στα ακόλουθα σημεία: 1. Σε επίπεδο υποδοχέα / προσδέματος (δομή, γλυκοσιλίωση, πυκνότητα, έκφραση διαλυτής/μεμβρανοσυνδεόμενης μορφής) 2. Σε επίπεδο μεταγωγής μηνύματος Σχηματισμός του DISC Καταρράκτης κασπασών Επαγωγή αναστολέων 3. Σε επίπεδο μιτοχονδρίου Έκφραση Bcl-2 Τροποποίηση της απόπτωσης μπορεί κλινικά να οδηγήσει σε θεραπείες που επηρεάζουν το προσβεβλημένο κύτταρο αφήνοντας το υγιές άθικτο;

87 Θεραπευτική προσέγγιση
Γενικές κατευθύνσεις της έρευνας: Ολιγονουκλεοτίδια με στόχο την αλλαγή της έκφρασης του γονιδίου της Βcl-2 Ειδικοί αναστολείς για τις ΒΗ περιοχές των Βcl-2 πρωτεϊνών Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες (ανάπτυξη αντισωμάτων) Οργανικές ενώσεις που παρεμποδίζουν την ενεργοποίηση των κασπασών Θεωρητικοί περιορισμοί: Μπορεί η απόπτωση να κατευθυνθεί ειδικά σε ένα όργανο ή κυτταρικό τύπο; Παραμένει λειτουργικό ένα κύτταρο στο οποίο έχουν τροποποιηθεί οι μηχανισμοί της απόπτωσής του;

88 1α) Αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια
Ολιγονουκλεοτίδιο G-3139 (5’-d(P-thio)TCT-CCC-AGC-GTG-CGC-CAT-3’) Δράση: Στοχεύει στα 6 πρώτα κωδικόνια του γονιδίου της Bcl-2 Εμποδίζει τη μετάφραση και την παραγωγή της Bcl-2 Τροποποιεί την ισορροπία μεταξύ προ-αποπτωτικών και αντι-αποπτωτικών μορίων της οικογένειας  απόπτωση Κλινική εφαρμογή: Μελάνωμα (43%), διάφορους καρκίνους - Ελαττώνει την αντοχή των κυττάρων στη χημειοθεραπεία

89 1β) Αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια
c-FLIP  απόπτωση Δράση: Επιτρέπει τη σύνδεση του FADD, δεν παρεμποδίζει την ενεργοποίηση της κασπάσης 8 Εφαρμογή: Αδενοκαρκινώματα (Fas/FasL- μεσολαβούμενα) survivin (IAP)  απόπτωση Δράση: Δεν παρεμποδίζει την ενεργοποίηση των κασπασών 3 και 7 Εφαρμογή: Καρκίνο πνεύμονα Bcl-xS  απόπτωση Δράση: Εμποδίζει τη δημιουργία της Bcl-xL πρωτεΐνης επιτρέποντας μόνο τη δημιουργία της Bcl-xS Εφαρμογή: Μικροκυτταρικούς καρκίνους

90 2a) Ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες προσδεμάτων κυτταρικού θανάτου
rTRAIL-πρόσδεμα  απόπτωση Δράση: Συνδέονται στους υποδοχείς TRAIL-R1 (DR4) και TRAIL-R2 (DR5) σχηματίζοντας λειτουργικό DISC και ενεργοποιούν την κασπάση 8 Προκλινικά δεδομένα: - SCID ποντίκια καταστρέφουν ξενογενείς καρκίνους - 80% των καρκινικών κυττάρων παρουσιάζουν ευαισθησία σε in vitro δράση rTNFα και rCD95L  τοξικά

91 Ομοίωμα TRAILυποδοχέα

92 3. Αναστολείς κασπασών Πεπτίδια κετονών που μιμούνται το ενεργό κέντρο των κασπασών (πχ benzyloxycarbolyl(z)-VAD-fluometh-ketone / fmk)  παρεμποδίζουν την απόπτωση Δράση: - Συνδέονται στο ενεργό κέντρο των κασπασών Δεν δείχνουν εξειδίκευση για συγκεκριμένη κασπάση Κλινική εφαρμογή: Οξεία φάση ισχαιμιών Μελλοντική χρήση: Μεταμοσχεύσεις οργάνων

93 ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ Κατάτμηση του DNA

94 1. Προσδιορισμός προτύπου αποπτωτικού DNA
Aρχή μεθόδου: DNA που απομονώθηκε από αποπτωτικά κύτταρα αναλύεται με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή αγαρόζης και βάφεται με βρωμιούχο εθίδιο. Χαρακτηριστικό πρότυπο DNA με μέγεθος πολλαπλάσιο των 180 bp Πλεονεκτήματα: όχι απαραίτητος ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός Μειονεκτήματα: μειωμένη ευαισθησία, μη-ποσοτική μέθοδος

95 2α) Προσδιορισμός νουκλεοσωμάτων με ELISA
DNA με χαμηλό μ.β. αναλύονται στο υπερκείμενο με sandwich ELISA Πλεονεκτήματα: ευαισθησία Μειονεκτήματα: όχι ομογενοποιήματα ιστών, άμεση ανάλυση

96 2α) Προσδιορισμός DNA με ELISA
Aρχή μεθόδου: τμήματα DNA απελευθερώνονται από τα αποπτωτικά κύτταρα μετά τη λύση τους. Απομόνωση με διαχωριστική φυγοκέντρηση του DNA με χαμηλό μ.β. από τα μεγάλα κομμάτια. DNA με χαμηλό μ.β. που έχουν ενσωματώσει BrdU αναλύονται στο υπερκείμενο ή σε εκχύλισμα κυττάρων με ELISA Πλεονεκτήματα: ευαισθησία, εφαρμογή και σε κυτταροτοξικότητα Μειονεκτήματα: προ-σήμανση, κύτταρα που πολλαπλασιάζονται

97 3. Μέθοδος TUNEL Aρχή μεθόδου: εντοπισμός ρήξης της αλυσίδας του DNA σε μονιμοποιημένα κύτταρα με τη βοήθεια σημασμένων νουκλεοτιδίων και εξωγενών ενζύμων (τελική τρανσφεράση, DNA πολυμεράση). Πλεονεκτήματα: μεγάλη ευαισθησία για αποπτωτικό θάνατο Μειονεκτήματα: ακριβή μέθοδος, απώλεια κυττάρων κατά τη μονιμοποίηση

98 4. Προσδιορισμός κασπάσης 3
Aρχή μεθόδου: προσδιορισμός ενεργοποιημένης κασπάσης 3 σε εκχύλισμα κυττάρων με τη βοήθεια ειδικού αντισώματος. Η κασπάση δρα σε συγκεκριμένο υπόστρωμα και ο ποσοτικός προσδιορισμός γίνεται με την απελευθέρωση ουσιών που φθορίζουν Πλεονεκτήματα: προσδιορισμός σε πρώιμο στάδιο, μεγάλη ευαισθησία

99 5. Μέθοδοι που προσδιορίζουν μεμβρανικές αλλαγές
Ανακατανομή φωσφολιπιδίων κατά την απόπτωση. Έκθεση της φωσφατιδυλοσερίνης στην εξωτερική πλευρά της κυτταρικής μεμβράνης

100 5α) Annexin-V Εξωγενής προσθήκη αννεξίνης με ειδικότητα δέσμευσης στη φωσφατιδυλοσερίνη. Σήμανση της αννεξίνης με FITC κάνει το σύμπλοκο ορατό με FACS ανάλυση ή μικροσκόπιο φθορισμού.

101 6. Προσδιορισμός πρωτεϊνών που σχετίζονται με την απόπτωση
Μονοκλωνικά αντισώματα έναντι των πρωτεϊνών: Fas Anti-Fas-Biotin: ανίχνευση του υποδοχέα σε τεχνικές Western blotting, FACS ανάλυση και ανοσοϊστοχημείας Bcl-2: ανίχνευση της πρωτεΐνης σε τεχνικές ανοσοϊστοχημείας με τη βοήθεια σημασμένου αντισώματος P53 (επάγει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα)