ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ

Παρουσίαση με θέμα: "ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΙΩΑΝΝΙΝΩΝ ΑΝΟΙΚΤΑ ΑΚΑΔΗΜΑΪΚΑ ΜΑΘΗΜΑΤΑ
Βιολογία ΙI Επιγενετικοί μηχανισμοί (Διάλεξη 2. Μ. Σύρρου) Διδάσκοντες: Σ. Γεωργάτος, Θ. Τζαβάρας, Π. Κούκλης, Χ. Αγγελίδης Υπεύθυνος μαθήματος: Σ. Γεωργάτος

2 Άδειες Χρήσης Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό υπόκειται σε άδειες χρήσης Creative Commons. Για εκπαιδευτικό υλικό, όπως εικόνες, που υπόκειται σε άλλου τύπου άδειας χρήσης, η άδεια χρήσης αναφέρεται ρητώς.

3 Μέθοδοι μελέτης μεθυλίωσης

4 Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς μεθυλιώνονται κυρίως οι κυτοσίνες στο 5’ άκρο του πυριμιδινικού δακτυλίου. Η μεθυλκυτοσίνη που προκύπτει (mC) βρίσκεται κυρίως σε (CpG) δινουκλεοτίδια. Αυτή η τροποποίηση έχει σημαντικά ρυθμιστικά αποτελέσματα στη γονιδιακή έκφραση ειδικά όταν περιλαμβάνονται πλούσιες σε CpG περιοχές που λέγονται νησίδες CpG και βρίσκονται στις περιοχές των υποκινητών των γονιδίων. Αν και σχεδόν όλες οι νησίδες που συνδέονται με γονίδια προστατεύονται από τη μεθυλίωση στα αυτοσωματικά χρωμοσώματα υπερμεθυλίωση των νησίδων CpG συνδέεται με μεταγραφική αδρανοποίηση γονιδίων που υπόκεινται σε γενετική αποτύπωση και γονιδίων που βρίσκονται στο αδρανοποιημένο Χ των γυναικών.

5 Η παρουσία 5-mC στον υποκινητή ειδικών γονιδίων μπορεί να μεταβληθεί η δυνατότητα πρόσδεσης μεταγραφικών παραγόντων και άλλων πρωτεϊνών με το DNA και συγκεντρώνει methyl-DNA-binding πρωτεΐνες και αποακετυλάσες ιστονών που συμπυκνώνουν την χρωματίνη στο σημείο έναρξης της μεταγραφής. Οι μηχανισμοί αυτοί σταματούν τη μεταγραφή και προκαλούν τη σιώπηση του γονιδίου. Η μεθυλίωση των καταλοίπων στο γενωμικό DNA παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Υπάρχουν πολλές τεχνικές μελέτης της μεθυλίωσης που βασίζονται στην κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο (sodium bisulfite) με σκοπό τον ποσοτικό προσδιορισμό της μεθυλίωσης των κυτοσινών σε ειδικές περιοχές του DNA.

6 Ευαίσθητα στη μεθυλίωση ένζυμα και ανάλυση κατά Southern ή PCR
μg γενωμικού DNA. Αποτελέσματα για μια μικρή περιοχή homepages.strath.ac.uk

7 Επίδραση με ΝaHSo3 στις κυτοσίνες αποδιαταγμένου DNA
Μέθοδος κατεργασίας με δισόξινο θειικό νάτριο (sodium bisulfite)-εισαγωγή εξαρτώμενων από τη μεθυλίωση πολυμορφισμών στο DNA Επίδραση με ΝaHSo3 στις κυτοσίνες αποδιαταγμένου DNA Μετά από

8 Κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο
Μετά από κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο μετατρέπονται οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες σε ουρακίλες, ενώ οι μεθυλιωμένες μένουν όπως είναι. Μετά από μετουσίωση και κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο, παίρνουμε δίκλωνο DNA με και η περιοχή-(αλληλουχίες) που μας ενδιαφέρει ενισχύεται με PCR.

9 Παραδείγματα

10 Αλληλούχιση μετά από κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο μεθυλιωμένου και μη μεθυλιωμένου DNA. ( ABI Prism 3130XL Applied Biosystems) Περιοχή υποκινητή γονιδίου σε μεθυλιωμένο (προστατευμένες κυτοσίνες, μπλέ) και μη μεθυλιωμένο (δεν υπάρχουν κυτοσίνες γιατί μετατράπηκαν σε θυμίνες) δείγμα.

11

12 Αποτελέσματα από αλληλούχιση DNA μετά από κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο.
DNA με μεθυλιωμένο CmpG (θέση #5). Η μεθυλιωμένη κυτοσίνη στη θέση #5 μένει άθικτη ενώ οι μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες (θέσεις #7, 9, 11, 14 and 15) μετατρέπονται σε ουρακίλη μετά από κατεργασία με δισόξινο θειικό νάτριο και αναγνωρίζονται σαν θυμίνες μετά από PCR.

13

14 wikipedia

15 MS-MLPA M Methylated Target Unmethylated Target
Denaturation and Multiplex probe hybridization. M Ligation and Digestion with methylation sensitive endonucleases. M Only undigested (methylated) and ligated probes are exponentially amplified.

16 Ευαίσθητες στη μεθυλίωση μικροσυστοιχίες DNA
Διαφορική υβριδοποίηση ολιγονουκλεοτιδίων που βρίσκονται στη μικροσυστοιχία με ανιχνευτές που έχουν υποστεί μετατροπή με δισόξινο. θειϊκό νάτριο

17 Microarray methylation

18 Τέλος Ενότητας

19 Χρηματοδότηση Το παρόν εκπαιδευτικό υλικό έχει αναπτυχθεί στα πλαίσια του εκπαιδευτικού έργου του διδάσκοντα. Το έργο «Ανοικτά Ακαδημαϊκά Μαθήματα στο Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων» έχει χρηματοδοτήσει μόνο τη αναδιαμόρφωση του εκπαιδευτικού υλικού. Το έργο υλοποιείται στο πλαίσιο του Επιχειρησιακού Προγράμματος «Εκπαίδευση και Δια Βίου Μάθηση» και συγχρηματοδοτείται από την Ευρωπαϊκή Ένωση (Ευρωπαϊκό Κοινωνικό Ταμείο) και από εθνικούς πόρους.

20 Σημειώματα

21 Σημείωμα Ιστορικού Εκδόσεων Έργου
Το παρόν έργο αποτελεί την έκδοση 1.0. Έχουν προηγηθεί οι κάτωθι εκδόσεις: Έκδοση 1.0 διαθέσιμη εδώ

22 Σημείωμα Αναφοράς Copyright Πανεπιστήμιο Ιωαννίνων, Διδάσκοντες: Σ. Γεωργάτος, Θ. Τζαβάρας, Π. Κούκλης, Χ. Αγγελίδης, Υπεύθυνος μαθήματος: Σ. Γεωργάτος. «Βιολογία ΙI. Επιγενετικοί μηχανισμοί». Έκδοση: 1.0. Ιωάννινα Διαθέσιμο από τη δικτυακή διεύθυνση:

23 Σημείωμα Αδειοδότησης
Το παρόν υλικό διατίθεται με τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Αναφορά Δημιουργού - Παρόμοια Διανομή, Διεθνής Έκδοση 4.0 [1] ή μεταγενέστερη. [1]