ΜΔΕ: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ

Παρουσίαση με θέμα: "ΜΔΕ: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΜΔΕ: ΕΦΑΡΜΟΓΕΣ ΤΗΣ ΒΙΟΛΟΓΙΑΣ ΣΤΗΝ ΙΑΤΡΙΚΗ
Συστήματα και μηχανισμοί επιδιόρθωσης DNA: από τη «βλάβη» στην ασθένεια ΑΝΤΩΝΟΓΛΟΥ ΑΝΑΣΤΑΣΙΑ

2 Ενδογενείς: υδρόλυση, οξείδωση, αλκυλίωση, mismatch
Τα κύτταρα εκτίθενται συνεχώς σε βλάβες του DNA είτε από προϊόντα του μεταβολισμού, είτε από περιβαλλοντικούς παράγοντες, ανέπτυξαν βιοχημικά μονοπάτια που ανταποκρίνονται σε ειδικές βλάβες. Αν η βλάβη είναι εκτεταμένη το κύτταρο οδηγείται σε απόπτωση. Εναλλακτικά το κύτταρο μπορεί να διορθώσει τη βλάβη αλλά να δημιουργήσει ένα ή περισσότερα λάθη, έτσι επιβιώνει έχοντας αποκτήσει μεταλλαγές οι οποίες ενδεχομένως επιτρέπουν φυσιολογικές κυτταρικές λειτουργίες. μεταλλαγές σε πρωτεΐνες που είναι σημαντικές για την επιδιόρθωση της βλάβης κ τα σημεία ελέγχου του κυτταρικού κύκλου είναι ιδιαίτερα ύπουλες για το κύτταρο. Αυξάνουν το ρυθμό με τον οποίο συσσωρεύονται οι μεταλλαγές σ ένα κύτταρο. (γονιδιακή αστάθεια) συνήθης κατάσταση των καρκινικών κυττάρων Ενδογενείς: υδρόλυση, οξείδωση, αλκυλίωση, mismatch Εξωγενείς: IR, UV, χημικοί παράγοντες

3 G1/S σημείο ελέγχου φωσφορυλίωση Chk1, Chk2 ATM, ATR CDC25
Αποικοδόμηση G1/S arrest Arrest λογω ανεοαρκούς φόρτωσης της cdc45 στη εναρξη της αντιγραφης

4 Φωσφορυλίωση-ενεργοποίηση
ATM, ATR, DNA-PK, Chk1, 2 p53 p21 CDKS 2, 4 G1 arrest Φωσφορυλίωση-ενεργοποίηση αναστολή

5

6 S σημείο ελέγχου NBS1, BRCA1, SMC1, 53BP1, MDC1 φωσφορυλίωση
Chk1, 2 CDC25A cyclinE/CDK2 S-arrest φωσφορυλίωση Αποικοδόμηση-απενεργοποίηση

7 G2/M σημείο ελέγχου CDC2 5A Chk1,2 φωσφορυλίωση αποφωσφορυλίωση CDC2
CDC-2/CYCLIN B ΜΙΤΩΣΗ φωσφορυλίωση αποφωσφορυλίωση

8

9 Μηχανισμοί επιδιόρθωσης προκαρυωτικών οργανισμών
ΦΩΤΟΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ή ΦΩΤΟΕΠΑΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ 2. ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΕΚΤΟΜΗ α. Επιδιόρθωση με ειδική εκτομή β. Επιδιόρθωση με γενική εκτομή ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΑΤΑΙΡΙΑΣΤΩΝ ΒΑΣΕΩΝ 4. ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΕΠΙΧΙΑΣΜΟ 5. SOS ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ

10 ΦΩΤΟΕΠΑΝΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ
Τ Τ Α Α Τ Τ Α Α hv μπλε φως PRΕ Τ Τ Α Α T T

11 ΕΠΙΔΙΟΡΘΩΣΗ ΜΕ ΕΚΤΟΜΗ ΒΑΣΗΣ ΒΕR=base excision repair
dRpase A I C A G T G T DNA λιγάση

12 Επιδιόρθωση αταίριαστων βάσεων

13

14 Επιδιόρθωση με επιχιασμό
Ένα σύστημα επιδιόρθωσης με ανασυνδυασμό χρησιμοποιεί ένα φυσιολογικό κλώνο DNA, για να αντικαταστήσει το χάσμα που έμεινε σε ένα νεοσύστατο κλώνο απέναντι από μια βλάβη η οποία δεν έχει επιδιορθωθεί.

15 SOS επιδιόρθωση LexA-καταστολέας της μεταγραφής
Γονίδια επιδιόρθωσης, ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, LexA, RecA, UmuC, UmuD Ισχυρή ακτινοβόληση Κατάσταση κυττάρου: OFF όταν η LexA καταστέλλει τα γονίδια στόχους, ON όταν τα γονίδια αυτά εκφράζονται σε υψηλά επίπεδα SOS επιδιόρθωση. Υπό φυσιολογικές συνθήκες στο κύτταρο λειτουργεί ένας καταστολέας της μεταγραφής, η πρωτείνη LexA και καταστέλλει μια μεγάλη ομάδα γονιδίων που αποτελούν το SOS ρυθμιστικό σύστημα. Η καταστολή δεν είναι πλήρης. Τα γονίδια παράγουν τα προιόντα τους σε ένα βασικό επίπεδο. Στα γονίδια αυτά υπάγονται γονίδια επιδιόρθωσης, ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου , τα γονίδια που κωδικοποιεί τις πρωτείνες LexA και RecA (το βασικό ένζυμο που καταλύει τον γενετικό ανασυνδυασμό και γονίδια που κωδικοποιούν τα ένζυμα UmuC και UmuD που επιδιορθώνουν το DNA προκαλώντας όμως μεταλλαγές.. Η SOS επιδιόρθωση ενεργοποιείται μετά από ισχυρή ακτινοβόληση οπότε η πρωτείνη RecA μετατρέπεται σε πρωτεάση και κόβει την LexA. Tότε όλα τα γονίδια του συστήματος ενεργοποιούνται και επιδιορθώνουν τις βλάβες προκαλώντας όμως μεταλλαγές.

16 Επιδιορθωτικοί μηχανισμοί στον άνθρωπο

17 Αριθμός γονιδίων και είδη συστημάτων επιδιόρθωσης
στον άνθρωπο Τα γονίδια επιδιόρθωσης μπορούν να χωριστούν σε μονοπάτια που χρησιμοποιούν διαφορετικούς μηχανισμούς για να αντιστρέψουν ή να προσπεράσουν μια βλάβη στο DNA.

18 MMR pathway –HNPCC NER pathway –XP –CS –TTD BER pathway –MAP Defective repair HR pathway –ATLD –BS –WS –RTS –NBS NHEJ pathway –SCID –RS-SCID

19 NER nucleotide excision repair
Οι πρωτεΐνες XPC, XPE και XPA αναγνωρίζουν τη βλάβη και “στρατολογούν” και τις άλλες απαραίτητες πρωτεΐνες Οι XPB και XPD είναι ελικάσες, υπομονάδες του TFIIH Οι XPF και XPG είναι νουκλεάσες που κόβουν τις αλυσίδες του DNA A) Many DNA lesions are detected directly by the XPCHR23B- Cen2 complex, through the structural distortion that they cause in DNA. (B) Lesions that cause little distortion can be recognized by the DDB complex. DDB is also part of an E3 ubiquitin (Ub) ligase that poly-ubiquitinates XPC and XPE. (C) Handover mechanism: ubiquitination of XPC increases its affinity for DNA, whereas ubiquitination of XPE leads to its degradation. (D) TFIIH opens a denaturation bubble of about 30 nucleotides around the lesion. (E) The XPA-RPA complex joins in and displaces the XPC complex. RPA binds to single-stranded DNA; XPA may confirm the presence of a lesion and/or serve to identify the damaged strand. (F)XPG incises the damaged strand in 3’ of the lesion, ERCC1-XPF in 5’ of it. (G) An oligonucleotide spanning the lesion is displaced and the resulting gap is filled by DNA polymerase delta or epsilon,likely associated to PCNA (b). (H) The nick is sealed byligase III, with a minor contribution of ligase I in replicating cells. (I) Transcription-coupled repair. RNA polymerase II (RNAPII) is stalled by lesions in the transcribed strand (TS) of active genes and attracts NER enzymes. (J) NER proceeds as for global genome repair (GGR), bypassing the XPC (and DDB) complexes but with a requirement for extra enzymes, CSA, CSB and XAB2, the function of which is not clear.This cartoon shows RNAPII backing up from the lesion to allow for repair, Κόβεται ένα τμήμα νουκλεοτιδίων Συμμετέχουν συνολικά 30 πρωτεΐνες

20 Αυτοσωμικές υπολειπόμενες ασθένειες από μεταλλαγές στο NER
xeroderma pigmentosum (XP), Cockayne Syndrome (CS), Trichothiodystropy (TTD). Τα άτομα έχουν σοβαρή υπερευαισθησία στο UV και οι ασθένειες είναι γενετικά ετερογενείς.

21 Xeroderma Pigmentosum- Μελαχρωστική ξηροδερμία
Ασθένεια με πολύπλοκο φαινότυπο Προβλήματα στο νευρικό σύστημα Ευαισθησία στο UV (καρκίνος του δέρματος) Βλάβη στα μάτια Απώλεια στην «απρογραμμάτιστη σύνθεση του DNA» Επιδιόρθωση με εκτομή μετά την έκθεση σε UV 7 γονίδια εμπλέκονται στην διαδικασία (XPA έως XPG) και ακόμη 20% των ασθενών δεν είναι σε αυτές τις ομάδες συμπληρωματικότητας. Τα γονίδια XP λειτουργούν για την αναγνώριση της βλάβης και την εκτομή. Η επιδιόρθωση είναι πιο πολύπλοκη στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς

22 Cockayne Syndrome (CS)
Το CS από μεταλλαγές σε δύο γονίδια (CSA και CSB) Οι πρωτεΐνες CS απαιτούνται για τα μεταγραφικά ενεργά γονίδια που επιδιορθώνονται με το NER Αναγνώριση βλάβης Έναρξη του TC-NER Ευαισθησία στο φως Μικροκεφαλία, οστεοπόρωση Κίφωση σπονδυλικής στήλης Καθυστέρηση στην ανάπτυξη Διανοητική καθυστέρηση Οφθαλμολογικές διαταραχές (καταρράκτης) 10-20 ετών Χωρίς προδιάθεση για καρκίνο δέρματος -Knockout CSB ποντίκια ήπια συμπτώματα -CSB/XPA πεθαίνουν γρήγορα

23 Trichothiodystropy(TTD)
Μεταλλαγές στα XP-D, ΧP-B, XP-G Ευαισθησία στον ήλιο Αταξία Ιχθύωση Ευαίσθητα μαλλιά και νύχια Νανισμός Όχι Ca δέρματος

24 ΒΕR Base Excision Repair
Επιδιόρθωση με ειδική εκτομή βλάβη σε αζωτούχο βάση του DNA. AP 3’ OH dRP MUTYH (ανάλογη της βακτηριακής mutY) Γλυκοζυλάση κόβει Α που ενσωματώνονται απέναντι από 8-oxoG μη επιδιόρθωση G:C →T:A στο APC γονίδιο σε MAP όγκους MAP:MUTYH - associated polyposis Μεταλλαγές στη MUTYH → πολλαπλά ορθοκολικά αδενώματα και καρκινώματα dRP AP λυάση FEN1: 5 άκρο ενδονουκλεάση 5-3 εξωνουκλεάση` η DNA polymerase (beta d, zeta r epsilon) προσθέτει αρκετά νουκλεοτίδια αντικαθιστώντας την dRP, σαν μέρος ενός "flap" ολιγονουκλεοτιδίου 80-90%

25 WS ο BER ξεκιναει με την αναγνωριση και απομακρυνση της βλαβης από μία DNA γλυκοζυλάση.( Only bifunctional DNA glycosylases are able to cleave the sugar–phosphate backbone and create a 5 phosphate (P) and a 3 phosphate or 3 polyunsaturated aldehyde (PUA), depending on the DNA glycosylase. After removal of the damaged base by monofunctional DNA glycosylases, strand scission is exerted by AP endonuclease, creating 3 hydroxyl (OH) and 5 deoxyribose-phosphate (dRP). These unconventional termini have to be restored to 3 OH and 5 P to allow further repair through deoxyribose-phosphatase diesterase (dRPase) activity of Pol β (5 dRP), diesterase activity of AP endonuclease (3 PUA), phoshatase activity of polynucleotide kinase phosphatase (PNKP) (3 P), or phosphatase activity of aprataxin (APTX) (3 P). Repair then proceeds via short-patch or long-patch repair. During short-patch repair, Pol β incorporates one nucleotide, followed by nick ligation by the XRCC1/LigIIIα complex (predominantly) or LigI. If the 5 lesion is refractory –απροσβλητο to cleavage by Pol β, the long-patch branch of BER is taken. Pol β and/or Pol δ/ε accomplish strand displacement by incorporating multiple nucleotides, followed by removal of the DNA flap containing the 5 refractory moiety by Flap endonuclease and ligation of the resulting nick by LigI. Supportive BER proteins are indicated in gray

26 Επιδιόρθωση BER Το BER έχει δύο υπο-οδούς που αρχίζουν με τη δράση μιας DNA γλυκοζυλάσης που κόβει τον γλυκοζιλικό δεσμό μετάβυ της τροποποιημένης βάσης και του φωσφωδιεστερικού σκελετού του DNA. Το κόψιμο αυτό παράγει μια απουρινική/απυριμιδινική (AP) η αβασική θέση στο DNA. Στον άνθρωπο έχουν βρεθεί 8 DNA γλυκοζυλάσες. AP θέσεις παράγονται και από αυθόρμητη υδρόλυση του N-γλυλοζιδικού δεσμού. Στη συνέχεια η AP ενδονουκλεάση 1 (APE1) κόβει τον γλυκοζιδικό δεσμό 5' πρό την AP θέση παράγοντας ένα 3' υδροξυλικό άκρο και μια παροδική 5' αβασική δεοξυριβοζυλ-φωσφωρική ομάδα (dRP). Η απομάκρυνση της dRP γίνεται απο την DNA πολυμεράση beta (Pol b), που προσθέτει ένα νουκλεοτίδιο στο 3' άκρο και απομακρύνει το dRP μέσω της ενεργότητας της AP λυάσης. Το nick του κλώνου κλείνει από την DNA λιγάση. Η αντικατάσταση της βλάβης με ένα νέο νουκλεοτίδιο αναφέρεται ως "short-patch" repair και αντιπροσωπεύει περίπου 80-90% όλου του BER.

27 Επιδιόρθωση BER Η άλλη οδός του BER, ονομάζεται "long-patch" επιδιόρθωση γίνεται όταν η τροποποιημένη βάση είναι ανθεκτική στην ενεργότητα της AP λυάσης της DNA Pol beta. Η Long-patch επιδιόρθωση καταλήγει στην αντικατάσταση περίπου 2-10 νουκλεοτιδίων συμπεριλαμβανομένης και της βάσης που έχει τη βλάβη. Η οδός αυτή έχει κοινά ένζυμα με την short-patch επιδιόρθωση όπως μια DNA γλυκοζυλάση, APE1 και DNA Pol beta. Όμως χρειάζεται το PCNA που είναι απαραίτητο στην αντιγραφή όπου η DNA polymerase (beta d, zeta r epsilon) προσθέτει αρκετά νουκλεοτίδια αντικαθιστώντας την dRP, σαν μέρος ενός "flap" ολιγονουκλεοτιδίου. Tο ολιγονουκλεοτίδιο που προκύπτει αποκόπτεται από την ενδονουκλεάση Flap FEN-1 και μετά γίνεται σύνδεση με μια DNA λιγάση.

28 Double Strand Break Repair in Eukaryotes
Μπορεί να οδηγήσει σε απώλεια της γενετικής πληροφορίας (κυτταρικό θάνατο ή καρκινογένεση). Ανασυνδυασμός ή σύνδεση των άκρων. Και οι δύο κλώνοι της διπλής έλικας του DNA είναι σπασμένοι. Δύο πιθανές οδοί Ομόλογος ανασυνδυασμός (HR) 10%, θηλαστικά, G2 ή S φάση, χρησιμοποιεί ομόλογες αλληλουχίες DNA ως μήτρα για επιδιορθωτική σύνθεση. Μη ομόλογος (NHEj) 90%, θηλαστικά, συνδέει τα σπασμένα άκρα δίκλωνων ρήξεων.

29 Rad50/Mre11/NBS1 ή MRN Βλάβη από IR - DSB Πρωτεΐνες αναγνώρισης
Πρωτεΐνες μεταγωγείς - ενίσχυση σήματος Πρωτεΐνες τελεστές επιτελούν ενζυματικές λειτουργίες: επεξεργασία άκρων DNA, επανασύνδεση, ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. DSB Ενεργοποίηση της ATM, επανατοποθετείται μέσω αλληλεπίδρασης με το Rad50/Mre11/NBS1 H2AX, Artemis, MDC1, NBS1, p53, Chk2, DNA-PKcs kinase Ενεργοποίηση σημείων ελέγχου, ΗΡ, ΝΗΕj Το MRN απαραίτητο για στρατολόγηση της ATM στο DSB και για την ικανοποιητική φωσφορυλίωση υποστρωμάτων. φωσφορυλίωση Δομική τροποποίηση πρωτεινών-συμβατή για ενίσχυση σήματος από πρω μεταγωγεις

30 ATM, NBS1 αναγνώριση των DSB
μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις BRCA1, MDC1, 53BP1 Ενίσχυση σήματος βλάβης DNA Μεταγωγή σήματος σε RAD51, Artemis, p53, Chk2

31 NHEj Ku70/80, DNA-PKCs στρατολογούνται στην περιοχή DSB για να προσδέσουν τα άκρα μεταξύ τους. Ενεργοποίηση των DNA-PKCs (φωσφορυλίωση εξαρτώμενη από την ATM) μέσω της αλληλεπίδρασης με το ετεροδιμερές και της ένωσης με τα άκρα των δίκλωνων ρήξεων, φωσφορυλιώσεις, αποφωσφορυλιώσεις σε κατάλοιπα θρεονίνης. Στρατολόγηση άλλων επιδιορθωτικών παραγόντων, Αrtemis, XRCC1/LigIV, XLF. Αποτελεσματικός, αλλά πιθανή απώλεια γενετικής πληροφορίας. Βλαβη από ιονιζουσα.οι υπομοναδες της DNA PK(πυρηνικη κιναση σερ θρεον.)κυ70/κυ80 προσδενονται στα ακρα. Αρχικα η KU συνδέεται στο DNA και μετατοπίζεται προς το εσωτ της ελικας.μετα στρατολογουν την καταλυτικη υπομοναδα της DNAPK,την DNA PKCS για να σταθεροποιηθεί η προσδεση.η DNA PKCS φωσφορ. Και αυτοφωσφ. Σε πολλα καταλοιπα θρεονινης Το συμπλεγμα θεωρειται ότι εμποδιζει την πρωιμη επεξεργασια των ακρων και την συνδεση τους.προστασια από νουκλεασες Η φωσφορ. Αποσταθεροποιει την προσδεση της DNAPKC η οποια αποδεσμευεται για να στρατολογηθουν ενζυμικες πρωτ για την επεξεργασια των ακρων.λιγαση iv και του MRN συμπλεγματος.το αποτελεσμα είναι φυσικη επανασυνδεση των ακρων και επιδιορθωση της βλαβης. Artemis είναι μια 5-3 ενδονουκλεαση η οποια φωσφορ από DNA PK και ετσι ενεργ η ενεργοτητα ανοιγμα φουρκετας.απομακρυνει 5΄προεξοχη και κονταινει το 3- ATM εμπλεκεται στον μηχανισμο αυτό μεσω φωσφορυλιωσης της artemis Επισης η φωσφ των DNA-PCKS στα καταλοιπα θρεονινησ είναι εξαρτωμενη από την ATM Η αναγκαιοτητα της ενεργοποιησης της των DNA-PCKS στην διεγερση της ενεργοτητας νουκλεασησ της αρτεμισ ενισχυει την σημαντικοτητα της ATM στο μονοπατι ARTEMIS νουκλεαση ρυθμιζομενη από την DNA-PCKS και σημαντικη για να προετοιμασει τα ακρα του DNA για την συνδεση τους (ligatable) SCID (Severe Combined Immunodeficiency) is associated with defective NHEJ repair system

32

33 HR S,G2 – παρουσία αδελφών χρωματίδων για την χρησιμοποίησή τους ως μήτρα. 1. Δημιουργία προεξέχοντος 3΄ άκρου με εκτομή DNA άκρου. Η ενζυματική αυτή τροποποίηση γίνεται από MRN σύμπλεγμα, EXO1 ή άγνωστες νουκλεάσες. 2. Πρόσδεση του RPA στην 3΄-προεξοχή, προστασία άκρων από περαιτέρω εκτομή και εμποδίζει τη δημιουργία δευτεροταγής δομής του μονόκλωνου DNA. 3. RPA αντικαθίσταται από την RAD51 η οποία πετυχαίνει την εισβολή στην αλυσίδα και σύνθεση χρησιμοποιώντας μία αδελφή χρωματίδη ως μήτρα (BRCA1, Fanconi πρωτεινες): ρύθμιση από CDK, Chk1 (διευκολύνει την διαδικασία του ομόλογου ανασυνδυασμού δια μέσου φωσφορυλίωσης της RAD51, κάτι που εξασθενεί την αλληλεπίδραση της RAD51 με την BRCA2. Η αλληλεπίδραση αυτή είναι απαραίτητη για την κατάλληλη πρόσδεση της RAD51 στη χρωματίνη). 4. Ανασυνδυασμός, διασταύρωση Holliday, μετανάστευση αλυσίδας, διαχωρισμός, ελικάσες (BLM,WRN), νουκλεάσες. HR υψηλή πιστότητα γιατί χρησιμοποιεί ομόλογη αλυσίδα DNA. Ο ανασυνδυασμος ,με το μοντελο Holliday ,διεκπεραιωνεται κ διαλυεται από ελικασες(κ νουκλεασες Chk1 διευκολυνει την διαδικασια του ομολογου ανασυνδυασμου δια μεσου φωσφορυλιωσης τηε RAD51 κατι που εξασθενει την αλληλεπιδραση της RAD51 με την BRCA2. η αλληλεπιδραση αυτή είναι απαραιτητη για την κατάλληλη προσδεση της RAD51 στη χρωματινη

34

35 Η NSB1 στρατολογει το M/R κοντασ τα DSBδια μεσου αλληλεπιδρασης με την ιστονη η οποία εχει φωσφορυλιωθει΄από την ATM.ετσι σχηματιζεται το συμπλεγμα MRN. Η ATM ρυθμιζει τι σημειο ελεγχου S KAI G2δια μεσου φωσφορυλιωσης της CHK2,SMC1.H NBS1 εμπλεκεται σε αυτές τις φωσφορυλιωσειςπιθανον ωσ μεταγωγεασ σηματοσ

36 ATM ATM μέλος της οικογένειας PI3-K
Πρωτεϊνική κινάση ενεργοποιούμενη από DSB, σημαντική για τη διατήρηση γονιδιακής σταθερότητας, ρύθμιση μήκους τελομερών, ενεργοποίηση σημείων ελέγχου, όπως και η NSB1 ATM μεταλλαγή AT (αταξία τελεγκιεκτασία) Αυτοσωμική υπολειπόμενη ασθένεια Υπερευαισθησία στην ακτινοβολία Ανοσοανεπάρκεια Παρεγκεφαλιδική αταξία, τελεγκιεκτασία Υψηλή επίπτωση κακοήθειας

37 Ρόλος της NBS1 α) με RAD50/Mre11 και το κατευθύνει στην περιοχή DSB b) με H2XA στρατολόγηση της NSB1 στα DSB NBS1 αλληλεπιδρά με ATM 1) Απαραίτητη για τη στρατολόγηση της ATM στην περιοχή DSB και ενεργοποίηση της ATM κινάσης 2) Ρύθμιση σημείων ελέγχου Μεταλλαγή στην NBS1 μειώνει την ενεργότητα του HR, δεν στρατολογείται η Mre11 στα DSB NBS

38 NBS (Nijmegan) ελαττωματικά σημεία ελέγχου αναπτυξιακή καθυστέρηση
ανοσοανεπάρκεια μικροκεφαλία λέμφωμα ευαισθησία στην ακτινοβολία χρωμοσωμικές θραύσεις (IR)

39 ATLD: MRE11, ελαττωματική DSB επιδιόρθωση
ATLD: MRE11, ελαττωματική DSB επιδιόρθωση. (ανοσοανεπάρκεια, νευροεκφυλισμός, πιο ήπια από AT, υπερευαισθησία στο IR). BS: αυτοσωμική υπολειπόμενη ασθένεια, μεταλλαγή στο γονίδιο BLM (ομόλογο του recQ), άυξηση χρωμοσωμικών θράυσεων και ανταλλαγών αδελφών χρωματίδων, μικρό αναλογικό μέγεθος, ανοοανεπάρκεια, στειρότητα στα αρσενικά, υπογονιμότητα στα θηλυκά, προδιάθεση για τύπου 2 διαβήτη, διάφοροι τύποι καρκίνου. H BLM συσσωρεύεται στις διχάλες αντιγραφής αλληλεπιδρά με την Rad51, μπλοκάροντας έτσι το σχηματισμό ανεπιθύμητου ανασυνδυασμού), με την MLH1, RPA. Ρυθμιστής του HR WS: αυτοσωμική υπολειπόμενη, WRN γονίδιο, πρώιμη ανάπτυξη, αλωπεκία, αθηροσκλήρυνση, οστεοπόρωση, διαβήτης τύπου 2, καταρράκτης, προδιάθεση για Ca (μεσεγχυματικής προέλευσης WRN: ελικάση (RecQ), εξωνουκλεάση (απομάκρυνση αταίριαστης βάσης) ,διαλύει δομές D θηλιάς που σχηματίζονται από τα τελομερή και εμποδίζει τον ανασυνδυασμό. NBS1 αλληλεπιδρά με ATM1),απαραίτητη για τη στρατολόγηση της ATM στην περιοχή DSB,και ενεργοποίηση της ATM κινάσης. 2)Ρύθμιση σημείων ελέγχου NBSIα)με rad/mre11 και το κατευθύνει στην περιοχή DSBb) με H2XA στρατολόγηση της nbs1 στα DSB Το MRN απαραίτητο για στρατολόγηση της ATM στο DSB και για την ικανοποιητική φωσφορίωση υποστρωμάτων Η BRCA1 ενεργοποιούμενη από την ATM (ataxia telangiectasia) διευκολυνει την προσδεση των BRCA2 and RAD51 of the overhang ακουλουθουμενη από τη προσελκυση της RAD54 με τη βοηθεια των BLM/WRN proteins. The homologous recombination is facilitated by large protein complexes at the DSBs. High incidence of leukemia, breastovarian, Werner's and Bloom's syndrome with severe premature aging and cancer is seen in defective HR repair system NBS1 σύμπλεγμα :επιδιόρθωση DSB μαζί με ATM κ H2AX στα ανθρώπινα κύτταρα Μεταλλαγή στην NBS1 μειώνει την ενεργότητα του HR,δεν στρατολογείται η Mre11 στα DSB BLM is cell-cycle regulated, exhibiting its lowest expression levels in early G1 phase and highest in late S and G2 Srs2 is an anti-recombination helicase that disrupts the binding of Rad51 to ssDNA, preventing the stable formation of nucleoprotein filaments and thereby blocking unwanted recombination events (Branzei et al., 2006; Krejci et al., 2003). Mammalian cells do not contain a homolog to yeast Srs2, yet BLM accumulates at stalled replication forks, and it may function in a way similar to Srs2 WRN is also effective at the removal of a single mismatched nucleotide at a recessed 30 end but not two mismatched nucleotides, and it is capable of initiating exonucleolytic degradation from a gap or a nick The WRN exonuclease can efficiently degrade a recessed 30 end on dsDNA or an RNA-DNA heteroduplex, whereas under most conditions it shows little or no exonuclease activity on blunt-ended DNA, DNA with a protruding 30 tail, or ssDNA

40 B). BidirectionalMMRrequires strand discontinuities
located either 5’ or 3’ to the mismatch (a). MutSa, a heterodimer composed of MSH2 and MSH6, binds the mismatch (b), recruits the MLH1-PMS2 heterodimer (MutLa) and undergoes a conformational switch upon exchange ofADPwithATP, allowing sliding away from the mismatch (c). A latent endonuclease activity in the PMS2 subunit of MutLa is activated in a MutSa-, RFC-, PCNA- and ATPdependent manner and introduces nicks in the discontinuous strand (red arrowhead) (d). This generates 5’ entry points for the 5’ to 3’ nuclease EXO1, independently of whether the initial strand discontinuity was located 5’ or 3’ to the mismatch. MutSa activated EXO1 subsequently degrades the nicked strand (e), generating single stranded gaps which are protected by RPA (f). POLd then loads at the 3 terminus and fills in the gap with help of its cofactorsPCNAandRFC. Finally,DNALigase I completes repair by sealing the remaining nick (g). (B)Recognition of a G·Tmismatch byTDGinvolves flipping of the substrate Tinto the active site pocket but also the establishment of contacts to the oppositeG, allowing excision ofTfrom G·T but not from A·T pairs (h). Flipping of the substrate base allows hydrolysis of the glycosydic bond, thus releasing the Tand generating an AP-site in the DNA strand (i). SUMOylation of TDG induces a conformational change, reducing its DNA binding affinity and facilitating dissociation of the glycosylase from the AP-site, which is then cleaved by APendonuclease 1 (APE1). Further processing of the single strand break may proceed by short (SP) or long patch (LP) repair (k). SP repair involves the action of Polb, which inserts one nucleotide and removes the dRP residue, followed by sealing of the DNA strand by the LIG III-XRCC1 complex. In LP repair, Pold/e assisted by the cofactors PCNAand RFC synthesizes amore extensive stretch ofDNA, resulting in displacement of the parental DNA strand. The resulting flap structure is cleaved by FEN1 and the nick sealed by LIG I. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA) has been identified as DNA polymerase processivity factor and has a role in repair at or prior to excision steps as a strand discriminating factor [ Αναγνωριση αταιριαστου ζευγους από MutSa (MSH2–MSH6) or MutSb (MSH2–MSH3, not shown) and MutLa (MLH1– PMS2) οδηγει στο σχηματισμό τριπλου συμπλοκου του οποιοου οι αλληλεπιδρασεισ πρω-πρωτ και πρωτ-DNA Ρυθμιζονται από ATP/ADP συμπαραγοντες προσδεδομενοι από την MutSa and MutLa (indicated by red *). PCNA ισως παιζει ένα σημαντικο ρολο στη στρατολογηση των MMR πρωτ στην γειτονια της διχαλας αντιγραφης δια μεσου του μοτιβου a PIP on MSH6 and MSH3. εγκοπη από ενδονουκλεαση,λειτουργια της PMS2 διεγειρομενη απο ATP, PCNA, and RFC and relevant protein–protein interactions (indicated by green arrow) μαλλον επιτυχανουν διαχωρισμο αλυσιδας,στοχευντας την επιδιορθωση στη νεοσυντεθεμενη αλυσιδαThe eukaryotic mismatch recognition complexes MutSa and MutSb as well as MLH1 all interact physically and functionally with PCNA (proliferating cell nuclear antigen), the trimeric sliding clamp facilitating processive DNA synthesis

41 HNPCC (Hereditary non polyposis colorectal coli)
Μεταλλαγές στα MMR γονίδια Αυτοσωμική επικρατής ασθένεια MLH1 (MSH2) % MSH % PMS1 PMS2 MLH3 EXO1 Χαμηλότερη συχνότητα

42

43