Κατέβασμα παρουσίασης
Η παρουσίαση φορτώνεται. Παρακαλείστε να περιμένετε
1
Τεχνικές ηλεκτροφόρησης, ανοσοκαθήλωσης, νεφελομετρίας
Παπαγεωργίου Αικατερίνη Βιολόγος Τμ. Ανοσολογίας – Ιστοσυμβατότητας Γ.Ν.Α. «ο Ευαγγελισμός»
2
Πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες
Αιματολογικά νοσήματα με χαρακτηριστική την παρουσία παραπρωτεΐνης στον ορό του αίματος ή και στα ούρα του ασθενούς Παραπρωτεΐνη χαρακτηρίζεται η ανοσοσφαιρίνη που παράγεται από πλασματοκύτταρα του ίδιου κλώνου. Γίνεται έκκριση: ολόκληρου μορίου παραπρωτεΐνης ελαφρών αλυσίδων τμημάτων βαρειών αλυσίδων Β λεμφοκύτταρα-> πλασματοκύτταρα -> παραγωγή ανοσοσφαιρινών Κακοήθεια ανεξέλεγκτος πολλαπλασιασμός πλασματοκυττάρων
3
Πλασματοκυτταρικές δυσκρασίες
Πολλαπλούν μυέλωμα Μονήρες πλασματοκύττωμα Πλασματοκυτταρική λευχαιμία MGUS Μακροσφαιριναιμία Waldestrοm Ανοσοκυτταρική πρωτοπαθής αμυλοείδωση Νόσος βαρειών αλυσίδων πολλαπλούν μυέλωμα συσσώρευση πλασματοκυττάρων στο μυελό και διήθηση άλλων οργάνων / παραγωγή παραπρωτεΐνης 10% των αιματολογικών κακοηθειών Μέση ηλικία διάγνωσης 68 έτη 2:3, γυναίκες: άνδρες IgG 50% , IgA 20%, κ,λ 15%, IgD 1-2%, IgE <1 τοις χιλίοις, Μη εκκριτικό <1% Κλινικές μορφές: Ασυμπτωματικό, Ελαφρών αλυσίδων, Μη εκκριτικό, Δικλωνικό Μονήρες πλασματοκύττωμα Συνήθως εντοπίζεται ο όγκος στη σπονδυλική στήλη ή στη λεκάνη. 70% εξέλιξη σε ΠΜ Και εξωμυελικά σε όργανα πχ, νεφροί, δέρμα. 30% εξέλιξη σε ΠΜ Πλασματοκυτταρική λευχαιμία Πλασματοκύτταρα > 2000/mm3 στο περιφερικό αίμα Συνήθως δευτεροπαθής εξέλιξη σε ΠΜ MGUS Monoclonal gammopathy undetermined significance Καλοήθης μονοκλωνική γαμμαπάθεια αδιευκρίνιστης αιτιολογίας ->1% σε πλασματοκυτταρική δυσκρασία Απουσία οστεολύσεων Παρουσία παραπρωτεΐνης που δεν σχετίζεται με υποκείμενο νόσημα. ->IgG<3.5g/dl, IgA<2.0 g/dl, Ελαφρές ούρων <1,0 g/24h Απουσία συμπτωμάτων Απουσία crab Μυελός<10% πλασματοκύτταρα Μακροσφαιριναιμία WALDESTROM Ισότυπος IgM Αναιμία, λεμφαδενοπάθεια,νεφρική και καρδιακή ανεπάρκεια Πρωτοπαθής αμυλοείδωση Εναπόθεση αμυλοειδούς (πολυμερές από μονομερή: τμήματα λ ελαφράς αλυσίδας) Στο τοίχωμα αγγείων και στο διάμεσο ιστό. Νόσοι βαρειών αλυσίδων Τμήματα G, A, M βαρειών αλυσίδων
4
Διαγνωστική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών
Ακτινολογικά ευρήματα Οστεοπώρωση Οστεολύσεις κατάγματα
5
Διαγνωστική προσέγγιση πλασματοκυτταρικών δυσκρασιών
Εργαστηριακά ευρήματα Αναιμία Τριψήφια ΤΚΕ Ανοσοπάρεση Υπερασβεσταιμία Πρωτεϊνουρία Νεφρική δυσλειτουργία
6
Εργαστηριακές τεχνικές ανάδειξης και ταυτοποίησης παραπρωτεΐνης
Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού Ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών ορού Η/Φ για την ανάδειξη IFE για ταυτοποίηση Ζητούνται ύστερα από συγκεκριμένα κλινικά, απεικονιστικά και εργαστηριακά ευρύματα.
7
Ολοκληρωμένη διαγνωστική προσέγγιση ΠΔ- σταδιοποίηση
Ηλεκτροφόρηση πρωτεϊνών ορού (Η/Φ) Ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών ορού (ΑΚΘ) Ποσοτικός προσδιορισμός ανοσοσφαιρινών ορού Μελέτη συμπυκνωμάτων ούρων 24ώρου με Η/Φ και ΑΚΘ β2 μικροσφαιρίνη Αλβουμίνη Free light chains
8
Ηλεκτροφόρηση Διαχωρισμός πρωτεϊνών ορού μέσα σε ηλεκτρικό πεδίο λόγω διαφορετικού Φορτίου Μοριακού βάρους, στερεοδιάταξης Διαχωρισμός πρωτεϊνικών μορίων όταν βρίσκονται σε ηλεκτρικό πεδίο που εφαρμόζεται σταθερή διαφορά δυναμικού με βάση το φορτίο, το ΜΒ, τη στερεοδιάταξη. Ταχύτητα ανάλογη του φορτίου, αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους. Φορτίζονται αρνητικά σε αλκαλικό pH και λόγω αμφολυτικού χαρακτήρα οδεύουν στο θετικό πόλο. Η αλβουμίνη πιο γρήγορη, οι σφαιρίνες ακολουθούν. Επάρματα αντιπροσωπεύουν κλάσματα πρωτεϊνών. Στην αγαρόζη ( ηλεκτροφορητικό μέσο,χαμηλή συγγένεια με πρωτεΐνες, ελεύθερη από ιονισμένες ομάδες), προσθήκη χρωστικής που συμπλοκοποιείται με πρωτεϊνικά μόρια και δίνει τις ζώνες που αντιστοιχούν στα αντίστοιχα κλάσματα. Αιμόλυση, λιπαιμία επηρρεάζουν την εικόνα.
12
Ηλεκτροφόρηση Ανίχνευση <<ζώνης>> παραπρωτεΐνης λόγω κοινής ηλεκτροφορητικής κινητικότητας των μορίων της Artifacts:α2 περιοχή λόγω φλεγμονώδους αντίδρασης αυξάνονται οι απτοσφαινίνες (συνυπάρχει και α1) β περιοχή 1) αιμόλυση ελεύθερη αιμοσφαιρίνη σύμπλεγμα και με την α2- απτοσφαιρίνη 2)αναιμία αύξηση τρανσφερίνης 3) υπερλιπιδαιμία αύξηση από-β γ περιοχή αυξημένο ινωδογόνο λόγω καθυστέρησης πήξης στο σωληνάριο
13
Τριχοειδική ηλεκτροφόρηση ζώνης Capillary zone electrophoresis (CZE)
Μετανάστευση πρωτεϊνών λόγω ηλεκτροσμωτικής ροής και ηλεκτροφορητικής κινητικότητας του κάθε κλάσματος Διαχωρισμός σε ζώνες Μέτρηση με άμεση απορρόφηση μονοχρωματικής ακτινοβολίας μέσω μικρού οπτικού παραθύρου στο τριχοειδές CZE capillary zone electrophoresis Τριχοειδή μήκους 20 cm , διαμέτρου μm. Οι πρωτεΐνες μεταναστεύουν λόγω ηλεκτρωσμωτικής ροής και ηλεκτροφορητικής κινητικότητας. Ταχύτητα ανάλογη του φορτίου και αντιστρόφως ανάλογη του μεγέθους τους. Διαχωρίζονται σε ζώνες, Βοβμαρδισμός από πηγή μονοχρωματικής ακτινοβολίας (laser) Μέτρηση με άμεση απορρόφηση μέσω μικρού οπτικού παραθύρου στο τριχοειδές. Μετατροπή των μετρήσεων απορρόφησης στο γνωστό μας ηλεκτροφόρημα και ανάδειξη των ζωνών φυσιολογικών και μη πρωτεϊνών. Ελάχιστη ποσότητα δείγματος – attomole Μεγαλύτερη δυνατή διαχωριστική ικανότητα Ελάχιστη κατανάλωση τοξικών οργανικών διαλυτών. Ο διαχωρισμός βασίζεται στις διαφορετικές ηλεκτροφορητικές κινητικότητες των διαλυτών μορίων άρα και στις ταχύτητες μετακίνησης των ιόντων στο ρυθμιστικό διάλυμα Το δυναμικό που αναπτύσσεται μεταξύ των καθηλωμένων ιόντων και του ιοντικού νέφους ονομάζεται ηλεκτροκινητικό δυναμικό. Με τη δίοδο του ρεύματος από ένα τέτοιο σύστημα τα καθηλωμένα ιόντα δεν κινούνται αλλά το ιοντικό νέφος είναι ελεύθερο να κινηθεί προς τον αντίθετα φορτισμένο πόλο. Επειδή το διάλυμα είναι υδατικό τα ιόντα είναι εφυδατωμένα οπότε η κίνηση του ιοντικού νέφους έχει σαν αποτέλεσμα να κινηθεί και διαλύτης. Η κίνηση αυτή του διαλύτη μαζί με τις διαλυμένες σε αυτόν ουσίες καλείται ηλεκτρωσμωτική ροή. Η ηλεκτρωσμωτική ροή έχει επίπεδο μέτωπο κάτι που οδηγεί σε υψηλή διαχωριστική ικανότητα. V=9000volt.
14
Τριχοειδική ηλεκτροφόρηση ζώνης Capillary zone electrophoresis (CZE)
Οι εικόνες που ακολουθούν δείχνουν ξεκάθαρα την ύπαρξη ή μη παραπρωτεΐνης πράγμα που δε συμβαίνει στην καθημέραν πράξη. Η τριχοειδική ηλεκτροφόρηση εφαρμόστηκε από το 1998 και η εφαρμοζόμενη τάση είναι 9000V. Ιστορικό ασθενούς για αποφυγή σφαλμάτων από τη δράση ορισμένων μεταβολιτών φαρμάκων.
15
Ψευδής παρουσία παραπρωτεΐνης:
Α) ινωδογόνο σε ασθενείς που παίρνουν ηπαρίνη ( μεταξύ β και γ σφαιρινών) Β) τρανσφερίνη σε ασθενείς με βαρειά σιδηροπενία ( β περιοχή) Γ) συμπλέγματα απτοσφαιρίνης- αιμοσφαιρίνης σε βαρειά αιμόλυση( μεταξύ β και γ σφαιρινών) Δ) ανοσοσυμπλέγματα ( μεταξύ β και γ σφαιρινών) Ε) CRP στη γ περιοχή (σε μεγάλη ποσότητά της)
19
Ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών ορού
Ημιαυτόματη μέθοδος Ηλεκτροφόρηση Επώαση με αντιορούς έναντι βαρειών και ελαφρών αλυσίδων Χρώση Ερμηνεία αποτελέσματος
20
Ανοσοκαθήλωση πρωτεϊνών ορού
Εφαρμογή από 1964.
32
Ηλεκτροφόρηση ούρων 24ώρου Ανοσοκαθήλωση ούρων 24ώρου
Ηλεκτροφόρηση ούρων 24ώρου Ανοσοκαθήλωση ούρων 24ώρου
34
Μυέλωμα ελαφρών αλυσίδων
35
Φαινόμενο προζώνης
40
Ποσοτικός προσδιορισμός ανοσοσφαιρινών ορού
Ποσοτικός προσδιορισμός ανοσοσφαιρινών ορού Νεφελομετρία: Βασίζεται στη μέτρηση του φωτός που σκεδάζεται καθώς διέρχεται από διάλυμα ανοσοσυμπλεγμάτων Ag-Ab Μέθοδοι: τελικού σημείου-μία μέτρηση Κινητική- BnII- δύο μετρήσεις Μέγιστης τιμής- συνεχείς μετρήσεις μέχρι την ισορροπία
41
Νεφελομετρία - Θολωσιμετρία
Βασίζεται στο φαινόμενο όπου το φως περνώντας από ένα μέσο με διασκορπισμένα σωματίδια διαφορετικού δείκτη διάθλασης από αυτόν του μέσου, Εξασθενεί σε ένταση λόγω σκεδασμού. Στη θολωσιμετρία μετράται η ένταση του φωτός που διαδίδεται μέσω του διαλύματος δηλ του μη σκεδαζόμενου φωτός (180 μοίρες από το προσπίπτον) Στη νεφελομετρία η ένταση του σκεδαζόμενου φωτός μετράται συνήθως υπό γωνία ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία. Θολωσιμετρία: υψηλής συγκέντρωσης διαλύματα Νεφελομετρία: χαμηλής συγκέντρωσης διαλύματα – πιο ακριβή αποτελέσματα
42
Ο σκεδασμός σχετίζεται με:
συγκέντρωση σκεδαζόμενων μορίων μέγεθος μορίων σχήμα μορίων antigen excess backround Η θολερότητα αυξάνεται με την προσθήκη του αντιγόνου στα αντισώματα και το σήμα αυξάνεται σε μια μέγιστη τιμή και ύστερα μειώνεται. Έντονος σκεδασμός δημιουργείται από χυλομικρά και λιποπρωτεΐνες.
46
Ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεϊνών ούρων 24ώρου
Σπειραματική βλάβη: Αλβουμίνη , τρανσφερίνη, IgG Σωληναριακή βλάβη (επαναρρόφηση): Α1 μακροσφαιρίνη, β2 μικροσφαιρίνη, κ,λ.
47
Μέτρηση των ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων του ορού (Free Light Chains, FLC) Bradwell και συν (2001)
2001 οι μελέτες σχετικά με τις ελεύθερες ελαφρές αλυσίδες. Γίνεται χρήση πολυκλωνικών αντιορών που αναγνωρίζουν κρυμμένους επιτόπους των ελαφρών αλυσίδων που είναι προσβάσιμοι μόνο όταν αυτές είναι ελεύθερες. Χρόνος ημίσειας ζωής για ελεύθερες 2-6 ώρες ενώ η IgG έχει 21 ημέρες. Άρα καλύτερος δείκτης παρακολούθησης. Η μορφή των μορίων μονομερή- διμερή- πολυμερή περιορίζει τη γραμμικότητα και επιταχύνει το σχημ αδρανών υλικών. Έτσι οδηγούμεστε στην υπερεκτίμηση της συγκέντρωσης αντιγόνου.
48
Free Kappa ( ) mg/l Free Lambda ( ) mg/l κ/λ ratio ( )
49
IMWG (2009) Κατευθυντήριες οδηγίες για τη χρήση
των μετρήσεων των ελεύθερων ελαφρών αλυσίδων free light chains (FLC) για τη διάγνωση, προγνωστική ταξινόμηση και παρακολούθηση ασθενών πασχόντων από ΠΔ Για διάγνωση: 70% μη εκκριτικό και για MGUS και ΠΜ ελαφρών αλυσίδων (τεκμηρίωση διάγνωσης) Για παρακολούθηση: μη εκκριτικό ΠΜ και πρωτ. Αμυλοείδωση. Στην πράξη σε όλες τις ΠΔ Αρνητικός προγνωστικός παράγοντας εκτός από ποσότητα παραπρωτεϊνης και ο λόγος κ/λ.
50
Οι συνδεδεμένες βαρειές/ ελαφρές αλυσίδες έχουν αξία ως προς την παρακολούθηση των ασθενών με ισότυπο IgG ή IgA. Οι τιμές του HLC ratio Δεν επηρρεάζονται από μεταβολές στον όγκο του πλάσματος. Σε περιπτώσεις με φυσιολογικά SPE και IFE έχουμε πρώιμες ενδείξεις για υποτροπή μερικούς μήνες πριν δείξουν τα υπόλοιπα. Ποσοτικοποίηση των μονοκλωνικών κλασμάτων.
51
β2 μικροσφαιρίνη Αλβουμίνη
52
Διεθνές σύστημα σταδιοποίησης (ISS) 2005
53
Για τεκμηριωμένη απάντηση:
Συνοψίζοντας… Για τεκμηριωμένη απάντηση: Εφαρμογή των προαναφερθέντων τεχνικών που αλληλοσυμπληρώνονται Εμπειρία Κλινική αξιολόγηση
54
Σας ευχαριστώ πολύ
Παρόμοιες παρουσιάσεις
