Εφαρμογές στην Τοξικολογία Κυτταρομετρία Ροής

Παρουσίαση με θέμα: "Εφαρμογές στην Τοξικολογία Κυτταρομετρία Ροής"— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Εφαρμογές στην Τοξικολογία Κυτταρομετρία Ροής
Εφαρμογές στην Τοξικολογία Κυτταρομετρία Ροής Δημήτριος Στάγκος Επίκουρος Καθηγητής Πανεπιστήμιο Θεσσαλίας Τμήμα Βιοχημείας & Βιοτεχνολογίας Εργαστήριο Φυσιολογίας Ζωικών Οργανισμών

2 Introduction to Flow Cytometry Web-Based Training

3 Κυτταρομετρία είναι η διαδικασία μέτρησης φυσικών και χημικών χαρακτηριστικών των κυττάρων.
Στη κυτταρομετρία ροής οι μετρήσεις γίνονται καθώς τα κύτταρα ρέουν ενώ βρίσκονται υπό τη μορφή εναιωρήματος σε ένα διάλυμα. Είναι μια τεχνολογία που επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση και ανάλυση πολλαπλών χαρακτηριστικών ενός κυττάρου (ή σωματιδίου) καθώς αυτό περνάει από μια δέσμη laser.

4 Είναι μια τεχνολογία που επιτρέπει την ταυτόχρονη μέτρηση και ανάλυση πολλαπλών χαρακτηριστικών ενός κυττάρου (ή σωματιδίου) καθώς αυτό περνάει από μια δέσμη laser.

5 Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ερευνητικές ή κλινικές εφαρμογές.

6 Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ερευνητικές ή κλινικές εφαρμογές.

7 Η κυτταρομετρία ροής μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση ευκαρυωτικών κυττάρων, βακτηρίων, χρωμοσωμάτων.

8 Συνήθως κύτταρα (ή σωματίδια) με μέγεθος 0,5-50μm μπορούν να αναλυθούν από ένα κυτταρόμετρο ροής.
Με την κυτταρομετρία ροής μετρώνται το μέγεθος ενός κυττάρου (ή σωματιδίου), η εσωτερική του πολυπλοκότητα και η ένταση του φθορισμού του.

9 Στην κυτταρομετρία ροής όλα τα δείγματα πρέπει να είναι σε μορφή διαλύματος.
Είναι δυνατή η ανάλυση κυττάρων από στερεούς ιστούς, αλλά θα πρέπει πρώτα να διαχωριστούν τα κύτταρα και να εναιωρηθούν σε κάποιο διαλύτη.

10 Η λειτουργία ενός κυτταρομέτρου ροής βασίζεται σε 3 κύρια μέρη:
Το ρευστό σύστημα (το σύνολο των διαφόρων διαλυμάτων που χρειάζονται για τη λειτουργία του). Το οπτικό σύστημα. Το ηλεκτρονικό σύστημα.

11 ΡΕΥΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ρευστό σύστημα (τα διαλύματα που τοποθετούμε στο κυτταρόμετρο) φέρνει τα κύτταρα στο ‘σημείο εξέτασης’ όπου προσπίπτει στα κύτταρα η δέσμη laser, και μάλιστα για να είναι σωστή η μέτρηση θα πρέπει η ακτίνα laser να συναντά τα κύτταρα στο κέντρο τους. Κάθε φορά που ένα κύτταρο (ή σωματίδιο) περνά από το σημείο εξέτασης και το συναντά (εξετάζει) η δέσμη laser αυτό ονομάζεται ‘συμβάν’ (event).

12 ΡΕΥΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Τα κύτταρα κινούνται προς το ‘σημείο εξέτασης’ μέσα σε ένα διάλυμα που λέγεται ‘κεντρικό δείγμα’.

13 Ο μεταλλικός σωλήνας μέσω του οποίου τα κύτταρα εισέρχονται στο κυτταρόμετρο ονομάζεται ‘σωλήνας ροής’.

14 ΡΕΥΣΤΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Τα κύτταρα περνάνε από το ‘σημείο εξέτασης’ ανά ένα κάθε φορά, δηλαδή δημιουργείται μια ροή κυττάρων έτσι ώστε το ένα να κινείται πίσω από το άλλο.

15 Μέσα στο σωλήνα ροής, το ‘κεντρικό δείγμα’ περιβάλλεται από ένα άλλο διάλυμα που ονομάζεται ‘διάλυμα κάλυψης’ (sheath fluid). O σωλήνας ροής έχει τέτοιο σχήμα ώστε το κεντρικό δείγμα να κινείται στο κέντρο του διαλύματος κάλυψης χωρίς να αναμιγνύονται τα δύο διαλύματα. Αυτή η διαδικασία ονομάζεται Υδροδυναμική Εστίαση. Στην Υδροδυναμική Εστίαση οφείλεται ουσιαστικά η κίνηση των κυττάρων σε μονή σειρά, δηλαδή η κίνηση του ενός μετά το άλλο μέσα στο σωλήνα ροής.

16 Το κεντρικό δείγμα πρέπει να έχει πάντα μεγαλύτερη πίεση από το δείγμα κάλυψης.
Το κυτταρόμετρο ροής μας δίνει τη δυνατότητα να μεταβάλλουμε την πίεση του κεντρικού δείγματος και έτσι να αυξηθεί ή να ελαττωθεί η διάμετρός του καθώς αυτό ρέει μέσα στο διάλυμα κάλυψης, και έτσι μπορεί να αυξηθεί ή να ελαττωθεί ο ρυθμός ροής των κυττάρων ή τα ‘συμβάντα’ ανά δευτερόλεπτο.

17 Αν αυξηθεί η πίεση του κεντρικού δείγματος τότε θα αυξηθεί η διάμετρός του , θα αυξηθεί ο ρυθμός ροής των κυττάρων, θα αυξηθεί ο αριθμός των ‘συμβάντων’ ανά δευτερόλεπτο και άρα θα μειωθεί ο χρόνος της μέτρησης. Ωστόσο, το μειονέκτημα σε αυτή την περίπτωση είναι ότι λόγω του μεγαλύτερου ρυθμού ροής του κεντρικού δείγματος μπορεί σε μία δεδομένη χρονική στιγμή να περάσουν περισσότερα του ενός κύτταρα από το σημείο εξέτασης, και έτσι κάποια κύτταρα να μη συναντούν τη δέσμη στο κέντρο της και να μειώνεται η ακρίβεια των μετρήσεων. Έτσι, η αύξηση της πίεσης του κεντρικού δείγματος μειώνει την ακρίβεια των μετρήσεων.

18 Επίδραση της πίεσης στο ρυθμό ροής του δείγματος
ΕΝΟΤΗΤΑ FLUIDICS, ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 7

19 Υπάρχουν κυτταρόμετρα όπου το δείγμα κινείται από κάτω προς τα πάνω και κυτταρόμετρα όπου το δείγμα κινείται από πάνω προς τα κάτω.

20 Υπάρχουν κυτταρόμετρα όπου το δείγμα κινείται από κάτω προς τα πάνω και κυτταρόμετρα όπου το δείγμα κινείται από πάνω προς τα κάτω.

21 ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το οπτικό σύστημα αποτελείται από το σύστημα οπτικής διέγερσης (excitation) και το σύστημα οπτικής συλλογής (collection). To σύστημα οπτικής διέγερσης, αποτελείται από την πηγή φωτός (laser) και από τα εξαρτήματα (οπτικές ίνες, φακούς και πρίσματα) που κατευθύνουν τη δέσμη laser στα κύτταρα, τα οποία διεγείρουν για να εκπέμψουν φθορίζουσα ακτινοβολία.

22 Το ορατό φως αποτελείται από ακτινοβολίες που κυμαίνονται από 400-700nm.

23 ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Συνήθως, τα περισσότερα κυτταρόμετρα έχουν 2ή 3 πηγές ακτινοβολίας laser με διαφορετικό μήκος κύματος. Υπάρχουν όμως και κυτταρόμετρα που μπορεί να έχουν έως και 12 laser διαφορετικού μήκους κύματος.

24 ΟΠΤΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Όταν η ακτινοβολία συναντήσει τα κύτταρα τότε σκεδάζει (διασκορπίζεται) σε 2 κατευθύνσεις. Ο σκεδασμός που γίνεται σε κατεύθυνση παράλληλη ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία ονομάζεται εμπρόσθιος σκεδασμός ‘(forward scatter). Ο σκεδασμός που γίνεται σε κατεύθυνση κάθετη ως προς την προσπίπτουσα ακτινοβολία ονομάζεται ‘πλευρικός σκεδασμός’ (side scatter). Εκτός από τον σκεδασμό, συμβαίνει και φθορισμός της ακτινοβολίας.

25 Το σύστημα οπτικής συλλογής κατευθύνει την σκεδάζουσα και τη φθορίζουσα ακτινοβολία , δηλαδή την εκπεμπόμενη ακτινοβολία (emission light) σε ‘ανιχνευτές’ (detectors) ακτινοβολίας. Το σύστημα οπτικής συλλογής αποτελείται από φακούς που μέσω οπτικών ινών κατευθύνουν την εκπεμπόμενη ακτινοβολία σε οπτικές ίνες. Οι οπτικές ίνες μεταδίδουν την ακτινοβολία σε φίλτρα και κάτοπτρα που στη συνέχεια μεταδίδουν ακτινοβολίες συγκεκριμένου μήκους κύματος στους ανιχνευτές.

26 H εκπεμπόμενη από τα κύτταρα ακτινοβολία (συγκεκριμένου μήκους κύματος) μπορεί να αναλυθεί με τα φίλτρα σε δύο ή περισσότερες ακτινοβολίες που θα καταλήξουν σε αντίστοιχους ανιχνευτές. Υπάρχουν οι ανιχνευτές με τριγωνική διάταξη που έχουνε 2 φίλτρα και άρα η ακτινοβολία laser μπορεί να αναλυθεί σε 2 ακτινοβολίες με διαφορετικά μήκη κύματος. Υπάρχουν οι ανιχνευτές με οκταγωνική διάταξη που έχουνε 5 φίλτρα και άρα η ακτινοβολία laser μπορεί να αναλυθεί σε 5 ακτινοβολίες με διαφορετικά μήκη κύματος.

27 Φίλτρα με μακρό πέρασμα (LP): Μεταδίδουν ακτινοβολία που είναι ίση ή μεγαλύτερη από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος (π.χ. 500 LP, μεταδίδει ακτινοβολία >500nm).

28 Φίλτρα με βραχύ πέρασμα (SP): Μεταδίδουν ακτινοβολία που είναι ίση ή μικρότερη από ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος (π.χ. 400 SP, μεταδίδει ακτινοβολία <400nm).

29 Φίλτρα με ευρύ πέρασμα (BP): Μεταδίδουν ακτινοβολία με μήκος κύματος που βρίσκεται ανάμεσα σε ένα συγκεκριμένο εύρος (π.χ. 500/20 BP, μεταδίδει ακτινοβολία nm).

30 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Το ηλεκτρονικό σύστημα αποτελείται από τους ανιχνευτές, τους ενισχυτές σήματος, τους επεξεργαστές σήματος και τον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Αρχικά, οι ανιχνευτές μετατρέπουν το φωτεινό σήμα που φτάνει στους ανιχνευτές σε ηλεκτρονικό σήμα (ηλεκτρικό ρεύμα). Το ηλεκτρονικό σήμα στη συνέχεια αυξάνεται από τους ενισχυτές. Οι επεξεργαστές σήματος μετατρέπουν το ενισχυμένο ηλεκτρονικό σήμα σε ψηφιακό σήμα που αντιστοιχεί σε μια συγκεκριμένη αριθμητική τιμή και το στέλνουν στον ηλεκτρονικό υπολογιστή.

31 Λειτουργίες ηλεκτρονικού συστήματος
Πιο συγκεκριμένα οι κύριες λειτουργίες του ηλεκτρονικού συστήματος είναι: Να μετατρέψει το ηλεκτρονικό σήμα σε αριθμητικά δεδομένα.

32 ΗΛΕΚΤΡΟΝΙΚΟ ΣΥΣΤΗΜΑ Έτσι, στον ηλεκτρονικό υπολογιστή αποθηκεύονται σε ψηφιακή μορφή οι πληροφορίες για κάθε κύτταρο και μπορούν στη συνέχεια να επεξεργαστούν με διάφορους τρόπους. Συγκεκριμένα, ο ηλεκτρονικός υπολογιστής μπορεί να κάνει στατιστική ανάλυση των αποτελεσμάτων και να τα παρουσιάσει με μορφή διαφόρων διαγραμμάτων.

33 Τύποι ανιχνευτών Οι ανιχνευτές (ή φωτοανιχνευτές) είναι αισθητήρες φωτός που διεγείρονται από φωτόνια και παράγουν ηλεκτρόνια.

34 Τύποι ανιχνευτών Στα κυτταρόμετρα ροής χρησιμοποιούνται οι εξής κατηγορίες φωτοανιχνευτών: 1) οι φωτοδίοδοι που είναι μικρής αποδοτικότητας και παράγουν ένα ηλεκτρόνιο ανά φωτόνιο. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ισχυρής ακτινοβολίας όπως αυτής που προέρχεται από τον ‘εμπρόσθιο σκεδασμό’ (forward scattering) του κυττάρου. 2) οι φωτοπολλαπλασιαστές που είναι μεγάλης αποδοτικότητας και παράγουν εκατομμύρια ηλεκτρόνια ανά φωτόνιο. Χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ασθενούς ακτινοβολίας όπως αυτής που προέρχεται από τον ‘πλευρικό σκεδασμό’ (side scattering) και τον φθορισμό του κυττάρου.

35 Τύποι ανιχνευτών Η τάση που εφαρμόζεται (και που μπορεί να καθοριστεί από τον χειριστή) σε ένα φωτοπολλαπλασιαστή καθορίζει και την ευαισθησία του. Όσο μεγαλύτερη τάση εφαρμόζεται τόσο μεγαλύτερος είναι ο αριθμός των ηλεκτρονίων που παράγονται ανά φωτόνιο και άρα τόσο μεγαλύτερη η ευαισθησία του. ΕΝΟΤΗΤΑ ELECTRONICS ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 7

36 Λειτουργίες ηλεκτρονικού συστήματος
Πιο συγκεκριμένα οι κύριες λειτουργίες του ηλεκτρονικού συστήματος είναι: Να αποκλείσει ‘συμβάντα’ με ασθενές σήμα που μπορεί να οφείλονται π.χ. σε ‘θόρυβο’ των μετρήσεων ή σε κυτταρικά υπολείμματα. Αυτό γίνεται με το να τίθεται μία τιμή ‘κατώφλι’ (threshold). Σήματα που έχουν μικρότερη τιμή από το κατώφλι αποκλείονται από τα αποτελέσματα. ΕΝΟΤΗΤΑ ELECTRONICS ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 8

37 Λειτουργίες ηλεκτρονικού συστήματος
Πιο συγκεκριμένα οι κύριες λειτουργίες του ηλεκτρονικού συστήματος είναι: Να αντιστοιχίσει ακτινοβολίες από laser διαφορετικού μήκους κύματος (όταν το κυτταρόμετρο έχει περισσότερα του ενός laser) σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο. ΕΝΟΤΗΤΑ ELECTRONICS ΔΙΑΦΑΝΕΙΑ 8

38 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ
Όταν η ακτινοβολία laser συναντήσει ένα κύτταρο (ή σωματίδιο) τότε σκεδάζεται (διασκορπίζεται). Εμπρόσθιος σκεδασμός (forward scatter) είναι ο σκεδασμός που συμβαίνει σε κατεύθυνση σχεδόν παράλληλη με αυτή της αρχικής ακτινοβολίας laser. Ο εμπρόσθιος σκεδασμός εξαρτάται από το μέγεθος του κυττάρου. Όσο μεγαλύτερο το μέγεθος του κυττάρου τόσο μεγαλύτερη η τιμή του εμπρόσθιου σκεδασμού.

39 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ
Πλευρικός σκεδασμός (side scatter) είναι ο σκεδασμός που συμβαίνει σε κατεύθυνση σχεδόν κάθετη με αυτή της αρχικής ακτινοβολίας laser. Ο πλευρικός σκεδασμός εξαρτάται από την εσωτερική πολυπλοκότητα του κυττάρου. Όσο μεγαλύτερο είναι η εσωτερική πολυπλοκότητα του κυττάρου τόσο μεγαλύτερη η τιμή του πλευρικού σκεδασμού. Έτσι, με βάση τον εμπρόσθιο και τον πλευρικό σκεδασμό μπορούμε να διακρίνουμε τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων σε ένα δείγμα όπου υπάρχουν περισσότεροι του ενός κυτταρικοί τύποι.

40 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ
Έτσι, με βάση τον εμπρόσθιο και τον πλευρικό σκεδασμό μπορούμε να διακρίνουμε τους διαφορετικούς τύπους κυττάρων σε ένα δείγμα όπου υπάρχουν περισσότεροι του ενός κυτταρικοί τύποι.

41 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ
Η διάκριση των διαφορετικών τύπων κυττάρων σε ένα δείγμα όπου υπάρχουν περισσότεροι του ενός κυτταρικοί τύποι γίνεται και με βάση τις διαφορετικές αντιγονικές ομάδες που υπάρχουν στην επιφάνεια των κυττάρων. Στην περίπτωση αυτή χρησιμοποιούνται μονοκλωνικά αντισώματα που συνδέονται με ένα συγκεκριμένο αντιγόνο του κυτταρικού τύπου που θέλουμε να ανιχνεύσουμε. Τα αντισώματα είναι επίσης συνδεδεμένα και με μία φθορίζουσα χρωστική. Η προσθήκη τέτοιων αντιγόνων σε έναν κυτταρικό πληθυσμό ονομάζεται ‘χρώση’ ή ‘επισήμανση’.

42 ΜΕΤΡΗΣΕΙΣ ΜΕ ΤΟ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΟ ΡΟΗΣ
Όταν η ακτινοβολία laser του κυτταρομέτρου προσπέσει σε ένα κύτταρο στο οποίο έχει συνδεθεί το συζευγμένο με τη φθορίζουσα χρωστική αντίσωμα τότε θα προκύψει φθορίζουσα ακτινοβολία συγκεκριμένου μήκου κύματος, και άρα μια αντίστοιχη τιμή που θα δείχνει ότι το κύτταρο ανήκει σε ένα συγκεκριμένο κυτταρικό τύπο.

43 Φθορίζουσες χρωστικές
Αν γίνει επισήμανση λεμφοκυττάρων που φέρουν το CD3+ αντιγόνο με μία φθορίζουσα χρωστική η εικόνα που θα δείξει το κυτταρόμετρο μετά τη μέτρηση θα είναι η εξής:

44 Φθορίζουσες χρωστικές
Μια φθορίζουσα χρωστική έχει την ιδιότητα όταν διεγερθεί από μια πηγή ενέργειας, όπως μια ακτινοβολία laser (excitation wavelength), να εκπέμπει ενέργεια με τη μορφή μιας νέας ακτινοβολίας μεγαλύτερου μήκους κύματος (emission wavelength) από αυτή που τη διέγειρε. Κάθε φθορίζουσα χρωστική χαρακτηρίζεται από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας (excitation wavelength) που μπορεί να τη διεγείρει και από το μήκος κύματος της ακτινοβολίας που εκπέμπει (emission wavelength).

45 Φθορίζουσες χρωστικές
Βέβαια, η εκπεμπόμενη ακτινοβολία κάθε φθορίζουσας χρωστικής έχει ένα φάσμα μήκους κύματος που χαρακτηρίζεται από μία μέγιστη τιμή. Οι πιο κοινές φθορίζουσες χρωστικές που χρησιμοποιούνται στην κυτταρομετρία ροής είναι η FITC, PE, PerCP-CyTM 5.5, PE-CyTM 7 και APC.

46 Φθορίζουσες χρωστικές
Σε ένα δείγμα μπορούν να προστεθούν περισσότερες από μία φθορίζουσες χρωστικές έτσι ώστε να γίνει ταυτόχρονη μέτρηση πολλών παραμέτρων. Στην περίπτωση αυτή οι διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές μπορούν να έχουν το ίδιο excitation wavelength αλλά πρέπει να έχουν διαφορετικό emission wavelength για να μπορεί να γίνει διάκριση του σήματος που στέλνει η κάθε χρωστική.

47 Αλληλεπικάλυψη φάσματος – Αντιστάθμιση (compensation)
Ακόμα όμως και αν οι διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές έχουν διαφορετικό emission wavelength μπορεί να υπάρχει μερική αλληλεπικάλυψη του φάσματος της ακτινοβολίας στην οποία εκπέμπουν με αποτέλεσμα να προκαλείται σύγχυση των σημάτων τους. Το φαινόμενο αυτό ονομάζεται ‘αλληλεπικάλυψη φάσματος’.

48 Αλληλεπικάλυψη φάσματος – Αντιστάθμιση (compensation)
Για παράδειγμα, έστω ότι σε ένα δείγμα έχουμε 2 διαφορετικούς κυτταρικούς τύπους. Για να τους διακρίνουμε θα χρησιμοποιήσουμε 2 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές που θα είναι συνδεδεμένες με αντισώματα ειδικά για τον κάθε κυτταρικό τύπο. Έστω ότι παρ’ όλο που οι 2 φθορίζουσες χρωστικές έχουν διαφορετικά emission wavelengths υπάρχει μερική αλληλεπικάλυψη των φασμάτων αυτών των ακτινοβολιών. Τότε στο διάγραμμα που θα παρουσιάζεται ο συνολικός κυτταρικός πληθυσμός, θα εμφανίζονται κύτταρα που θα είναι σαν να έχουν συνδεθεί και με τις 2 χρωστικές.

49 Αλληλεπικάλυψη φάσματος – Αντιστάθμιση (compensation)

50 ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Οι μετρήσεις για κάθε κύτταρο αποθηκεύονται στον ηλεκτρονικό υπολογιστή. Τα δεδομένα που αφορούν ένα συγκεκριμένο κυτταρικό πληθυσμό μπορούν να παρουσιαστούν με τη μορφή διαφόρων διαγραμμάτων.

51 ΑΝΑΛΥΣΗ ΔΕΔΟΜΕΝΩΝ Οι τιμές μπορεί να παρουσιαστούν σε ένα διάγραμμα σε λογαριθμική κλίμακα ή και σε εκθετική κλίμακα για να αυξηθεί το εύρος των τιμών των χαρακτηριστικών που μετρήθηκαν.

52 Β Α D C ΤΥΠΟΙ ΔΙΑΓΡΑΜΜΑΤΩΝ
Ιστόγραμμα (A): Παρουσιάζει τις τιμές ενός χαρακτηριστικού των κυττάρων σε σχέση με τον αριθμό των κυττάρων. Dot plot (B): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων. Διάγραμμα πυκνότητας (density plot) (C): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παρουσιάζει με διαφορετικό χρώμα κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά. Διάγραμμα εμβαδού (contour plot)(D): Παρουσιάζει τις τιμές 2 διαφορετικών χαρακτηριστικών των κυττάρων αλλά παράλληλα διαχωρίζει σε διαφορετικές περιοχές κύτταρα με παραπλήσιες τιμές και για τα 2 χαρακτηριστικά. Β Α D C

53 Καθορισμός ενός συγκεκριμένου πληθυσμού κυττάρων (Gate)
Σε ένα πληθυσμό κυττάρων που θα μετρηθεί με το κυτταρόμετρο, μπορεί να θέλουμε να περιορίσουμε την ανάλυσή μας σε ένα συγκεκριμένο υποπληθυσμό κυττάρων ή σε ένα υποσύνολο δεδομένων. Η διαδικασία για να γίνει αυτό ονομάζεται : gating Συνήθως, το ‘gating’ γίνεται σε ένα διάγραμμα dot plot όπου φαίνονται οι τιμές του ‘εμπρόσθιου’ και του ‘πλευρικού’ σκεδασμού. Μπορούμε επιλέξουμε τον υποπληθυσμό που μας ενδιαφέρει σχεδιάζοντας γύρω από αυτόν ένα πολύγωνο. Μετά το ‘gating’, δηλαδή την επιλογή του συγκεκριμένου υποπληθυσμού, σε όλα τα διαγράμματα θα εμφανίζονται οι τιμές που θα αφορούν μόνο αυτόν τον πληθυσμό.

54 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
Με την κυτταρομετρία ροής μπορούμε να προσδιορίσουμε διάφορους δείκτες οξειδωτικού στρες σε κύτταρα. Έτσι, μπορούμε να διαπιστώσουμε το οξειδωτικό στρες που προκαλεί ένας οξειδωτικός παράγοντας ή την αντιοξειδωτική δράση μιας ένωσης.

55 Ελεύθερες ρίζες Ελεύθερη ρίζα είναι κάθε άτομο ή μόριο στοιχείου ή χημικής ένωσης το οποίο περιέχει ένα ή περισσότερα μη ζευγαρωμένα ηλεκτρόνια – Η πιο απλή ελεύθερη ρίζα είναι το άτομο του υδρογόνου + Οι σημαντικότερες ελεύθερες ρίζες που παράγονται στο εσωτερικό των κυττάρων είναι: O2•–, OH•, RO•, ROO •, NO• Υπάρχουν ενώσεις που δεν είναι ελεύθερες ρίζες αλλά παίζουν σημαντικό ρόλο στο σχηματισμό τους π.χ. H2O2, ONOO-

56 Σχηματισμός ελευθέρων ριζών Ιονίζουσα ακτινοβολία
Κάπνισμα Μεταβολισμός Βλάβες στο DNA Μιτοχόνδριο Φλεγμονή Ατμοσφαιρική ρύπανση Φαγοκύτταρα

57 αντιοξειδωτικών μηχανισμών
Οξειδωτικό στρες Μείωση των αντιοξειδωτικών μηχανισμών Αντιοξειδωτικοί μηχανισμοί Σχηματισμός ελευθέρων ριζών Σχηματισμός ελευθέρων ριζών & οξειδωτική βλάβη

58 Αντιοξειδωτικό Ελεύθερες ρίζες

59 Κατηγορίες Αντιοξειδωτικών
Ένζυμα Δισμουτάση του υπεροξειδίου Υπεροξειδάση της γλουταθειόνης Καταλάση Πρωτεΐνες πλάσματος (αίμα) Αλβουμίνη Σερουλοπλασμίνη Τρανσφερίνη Μη ενζυμικά αντιοξειδωτικά Τοκοφερόλη (Βιταμίνη Ε) Καροτενοειδή Πολυφαινόλες Ασκορβικό οξύ (βιταμίνη C) Ουρικό οξύ Τα αντιοξειδωτικά μπορούν να ταξινομηθούν στις παρακάτω κατηγορίες: 1. Ενδογενή αντιοξειδωτικά συστήµατα π.χ. GSH γλουταθειόνη, καταλάση ή δισµουτάση του ανιόντος υπεροξειδίου (S.O.D.), αφυδρογονάση της 6-φωσφορικής γλυκόζης (G-6-PD) 2. ’λλες ενδογενείς αντιοξειδωτικές ουσίες π.χ. αλβουµίνη, ουρικό οξύ, χολερυθρίνη. 3. Αντιοξειδωτικές βιταµίνες (π.χ. βιτ. Ε, C, καροτενοειδή) 4. Άλλα αντιοξειδωτικά που προσλαµβάνονται µε την διατροφή π.χ. συνένζυµο Q10, πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, κυστείνη, σελήνιο, ψευδάργυρος, φλαβονοειδή Πρωτεάσωμα. Eλαττώνουν τη δημιουργία ΔΕΟ, μέσω της απομάκρυνσης οξειδωτικών ή μετατρέποντας τα ΔΕΟ, σε σχετικά σταθερές χημικές ενώσεις. Ατογλοβίνη Haptoglobin (abbreviated as Hp) is the protein that in humans is encoded by the HP gene.[1][2] In blood plasma, haptoglobin binds free hemoglobin (Hb) released from erythrocytes with high affinity and thereby inhibits its oxidative activity.the haptoglobulin assay is used to screen for and monitor intravascular hemolytic anemia . Δεσμεύουν μεταλλικά ιόντα και ως εκ τούτου περιορίζουν τη δημιουργία ελεύθερων ριζών, μέσω αντιδράσεων που καταλύονται από μέταλλα. PON1 is responsible for hydrolysing organophosphate pesticides and nerve gasses. Polymorphisms in the PON1 gene significantly affect the catalytic ability of the enzyme.[3] PON1 (paraoxonase 1) is also a major anti-atherosclerotic component of high-density lipoprotein (HDL).[4][5] The PON1 gene is activated by PPAR-γ, which increases synthesis and release of paraoxonase 1 enzyme from the liver, reducing atherosclerosis.[6] Αλβουμίνη Η Αλβουμίνη συντίθεται στα ηπατοκύτταρα και εισέρχεται στην κυκλοφορία διαμέσου της ηπατικής φλέβας. Η πρωταρχική λειτουργία της αλβουμίνης είναι η διατήρηση της κολοειδικής οσμωτικής πίεσης τόσο στον αγγειακό όσο και στον εξωαγγειακό χώρο. Η αλβουμίνη δεσμεύει και μεταφέρει μεγάλο αριθμό ουσιών όπως ελεύθερα λιπαρά οξέα, φωσφολιπίδια, μεταλλικά ιόντα, αμινοξέα, φάρμακα, ορμόνες και χολερυθρίνη. Η αλβουμίνη είναι απαραίτητη τόσο για τον μεταβολισμό όσο και για την αποτοξίνωση πολλών εξ' αυτών. Η αλβουμίνη λειτουργεί ως πηγή αμινοξέων για τους περιφερικούς ιστούς μεταφέροντας τα αμινοξέα που προέρχονται από την τροφή ή παρέχοντας αμινοξέα κατά τον καταβολισμό της. Η αλβουμίνη είναι σημαντικό συστατικό της αντιοξειδωτικής δραστηριότητας του πλάσματος κυρίως με το να δεσμεύει ελεύθερα λιπαρά οξέα, δισθενή κατιόντα και χολερυθρίνη. Η αλβουμίνη δρα ως ρυθμιστικό διάλυμα σε παθολογικές καταστάσεις. Η αλβουμίνη αναστέλλει την παραγωγή λευκοτριένης και ακτίνης αναστέλλοντας έτσι την φλεγμονώδη απάντηση των αιμοπεταλίων και ουδετεροφίλων. Κλινική χρησιμότητα • Παρακολούθηση ασθενών με οξεία ηπατική νόσο • Παρακολούθηση ασθενών με ηπατική κίρρωση • Διαγνωστική διερεύνηση οιδηματικών καταστάσεων • Προγνωστικός παράγων σε υπερήλικες νοσηλευόμενους ασθενείς Η χολερυθρίνη είναι μία από τις παραμέτρους της γενικής εξέτασης ούρων. Αποτελεί προϊόν του καταβολισμού της αίμης που προέρχεται κατα 85% από την αιμοσφαιρίνη αλλά και από καταλάσες και κυττοχρώματα. Η χολερυθρίνη εκκρίνεται στην χολή και στα ούρα στα οποία τους προσδίδει το χαρακτηριστικό κίτρινο χρώμα τους. Αυξημένες τιμές της προκαλούν το έντονο κίτρινο χρώμα που χαρακτηρίζει τους ασθενείς με ίκτερο. Στην περίπτωση που υπάρχει βλάβη στο ήπαρ ή απόφραξη στις χοληφόρους οδούς, ποσότητα άμεσης χολερυθρίνης διαρρέει εκτός των ηπατοκυττάρων και μεταφέρεται στα ούρα, στα οποία προσδίδει ένα σκούρο κεχριμπαρένιο χρώμα, το οποίο χαρακτηρίζεται ως ικτερικό. Η σερουλοπλασμίνη είναι α2 - σφαιρίνη που περιέχει περίπου το 95% του ολικού χαλκού στον ορό. Η σερουλοπλασμίνη συντίθεται κυρίως στο ήπαρ και σε μικρές ποσότητες στα μακροφάγα και λεμφοκύτταρα. Ο κύριος φυσιολογικός ρόλος της σερουλοπλασμίνης αφορά αντιδράσεις οξειδο- αναγωγής, ιδιαίτερα την οξείδωση του Fe2+ σε Fe3+. Είναι επίσης σημαντική στον έλεγχο της οξείδωσης των λιπιδίων των μεμβρανών. Η σερουλοπλασμίνη πιθανώς να μεταφέρει χαλκό στους ιστούς. Βιταμίνη Ε: κύριο ανιτοξειδωτικό λιπιδίων ! β-καροτένιο

60 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΕΛΕΥΘΕΡΩΝ ΡΙΖΩΝ (ROS) Για τον προσδιορισμό του συνολικού επιπέδου των ROS στα κύτταρα με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιούμε τη φθορίζουσα χρωστική ,7-dichlorofluorescein diacetate (DCFDA). Η DCFDA μετά την είσοδό της στα κύτταρα από-ακετυλιώνεται από κυτταρικές εστεράσες σε ένα μη φθορίζον προϊόν το οποίο οξειδώνεται από τις ROS σε 2,7-dichlorofluorescin (DCF). Η DCF είναι μια φθορίζουσα χρωστική (excitation 495nm, emission 529nm) που μπορεί να προσδιοριστεί με κυτταρομετρία ροής. Άρα, από τα επίπεδα της DCF υπολογίζονται τα επίπεδα των ROS: όσο μεγαλύτερη η τιμή της DCF, τόσο περισσότερες οι ROS.

61 «Μελέτη δεικτών οξειδωτικού στρες (ROS) σε μυϊκά κύτταρα με την χρήση flow cytometry, έπειτα από χορήγηση εκχυλίσματος στεμφύλων»

62 Κύτταρα C2C12 Πρόκειται για κύτταρα που προέρχονται από μυοβλαστική κυτταρική σειρά ποντικού. Τα κύτταρα επωάστηκαν με το εκχύλισμα για 24 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις. Έγινε προσδιορισμός των ROS με τη χρωστική DCFDA.

63 Αποτελέσματα flow cytometry

64 Αποτελέσματα flow cytometry
 Μπλε γραμμή: μάρτυρας  Πράσινη γραμμή: 2,5 μg/mL  Κόκκινη γραμμή: 5 μg/mL  Κίτρινη γραμμή: 10 μg/mL

65 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSH) Η γλουταθειόνη (GSH) είναι η πιο άφθονη θειόλη στους ιστούς των ζώων και του ανθρώπου. Είναι ένα τριπεπτίδιο που αποτελείται από γλουταμινικό οξύ, γλυκίνη και κυστεΐνη. Οι αναγωγικές (αντιοξειδωτικές) της ιδιότητες παίζουν σημαντικό ρόλο σε διάφορα μεταβολικά μονοπάτια όπως και στο αντιοξειδωτικό σύστημα των περισσότερων αερόβιων κυττάρων. Χημική δομή της γλουταθειόνης

66 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSH) Για τον προσδιορισμό της GSH χρησιμοποιείται η φθορίζουσα χρωστική mercury orange (excitation 488nm, emission 580nm) η οποία συνδέεται με τη GSH. Μπλε γραμμή: μάρτυρας Πράσινη γραμμή: 2,5 μg/mL Κόκκινη γραμμή: 5 μg/mL Κίτρινη γραμμή: 10 μg/mL

67 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΟΞΕΙΔΩΤΙΚΟΥ ΣΤΡΕΣ ΣΕ ΚΥΤΤΑΡΑ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΓΛΟΥΤΑΘΕΙΟΝΗΣ (GSH) Για τον προσδιορισμό της GSH χρησιμοποιείται η φθορίζουσα χρωστική mercury orange (excitation 488nm, emission 580nm) η οποία συνδέεται με τη GSH. Μπλε γραμμή: μάρτυρας Πράσινη γραμμή: 2,5 μg/mL Κόκκινη γραμμή: 5 μg/mL Κίτρινη γραμμή: 10 μg/mL

68 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
Η απόπτωση, ένας προγραμματισμένος κυτταρικός θάνατος, είναι από τους σημαντικότερους μηχανισμούς με τους οποίους αντικαρκινικές ενώσεις ασκούν τη δράση τους. Για τον προσδιορισμό της επαγωγής της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα από αντικαρκινικούς παράγοντες χρησιμοποιούνται οι χρωστικές Annexin V-FITC και 7-Aminoactinomycin D (7-AAD) για τη χρώση των αποπτοτικών και νεκρωτικών κυττάρων αντίστοιχα. Η Annexin V είναι μια πρωτεΐνη που συνδέεται με τη φωσφατιδυλσερίνη. Η φωσφατιδυλσερίνη είναι ένα φωσφολιπίδιο της εσωτερικής δομής των κυτταρικών μεμβρανών. Στα αποπτωτικά κύτταρα η φωσφατιδυλσερίνη μεταφέρεται στην επιφάνειά τους όπου μπορεί να συνδεθεί με την Annexin V. Η Annexin V είναι συζευγμένη με τη χρωστική FITC προκειμένου να γίνει ανίχνευση των αποπτικών κυττάρων με κυτταρομετρία ροής. Η 7-AAD είναι μια φθορίζουσα χρωστική που συνδέεται με το DNA. Η 7-AAD μπορεί να εισέλθει μόνο σε νεκρωτικά κύτταρα όπου έχει γίνει λύση της κυτταρικής τους μεμβράνης, για αυτό και χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό των νεκρωτικών κυττάρων.

69 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΑΠΟΠΤΩΣΗΣ ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ
Συγκεκριμένα, θα γίνει επίστρωση των καρκινικών κυττάρων σε φλάσκες καλλιέργειας (25 cm2). Τα κύτταρα επωάζονται με τον αντικαρκινικό παράγοντα για διαφορετικά χρονικά διαστήματα. Μετά την επώαση, τα κύτταρα συλλέγονται με τρυψινοποίηση, φυγοκεντρούνται και εναιωρούνται σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (pH 7,4). Στο εναιώρημα των κυττάρων προστίθενται οι χρωστικές Annexin V-FITC και 7-AAD για τη χρώση των αποπτοτικών και νεκρωτικών κυττάρων αντίστοιχα. Μετά τη χρώση, τα κύτταρα τοποθετούνται στο κυτταρόμετρο ροής (BD FACSCalibur), προσδιορίζονται οι χρωστικές Annexin V-FITC και 7-AAD και οι μετρήσεις επεξεργάζονται με το πρόγραμμα CELLQuest Pro (BD) ώστε να υπολογιστεί το % ποσοστό των ζωντανών, προ-αποπτικών, αποπτικών και νεκρωτικών κυττάρων.

70 Αποτελέσματα Κυτταρομετρία Ροής - Απόπτωση
Αποτελέσματα Κυτταρομετρία Ροής - Απόπτωση Αντιπροσωπευτικές εικόνες της μελέτης της απόπτωσης με κυτταρομετρία ροής μετά από χρώση με Annexin V και 7AAD των MCF-7 κυττάρων που επωάστηκαν με το Εκχύλισμα 3 (απόρριμμα-φλοιός) σε συγκέντρωση 50μg/ml , για 0, 0.5, 1, 2, 4 και 6 ώρες.

71 Κυτταρομετρία Ροής - Απόπτωση

72 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΦΑΣΕΩΝ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ
ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ G1 G0 S G2 M

73 ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ ΤΩΝ ΦΑΣΕΩΝ ΤΟΥ ΚΥΤΤΑΡΙΚΟΥ ΚΥΚΛΟΥ
ΜΕ ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ Το DNA συνδέεται με μια φθορίζουσα χρωστική (π.χ. propidium iodide) S Phase G1 G2/M Basic quantitaion of cell cycle phase (CellQuest) Note linear scale! DNA Content

74 Example 2: S phase block T0 T24
G1 S G2 Example 2: S phase block T0 T24

75 G1 S G2 Example 3: G2 block T0 T24