ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5 / 15- 10 -2012 Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: αναγνώριση από υποδοχέα Β ή από υποδοχέα Τ + ΜΗC μόρια Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο.

Παρουσίαση με θέμα: "ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5 / 15- 10 -2012 Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: αναγνώριση από υποδοχέα Β ή από υποδοχέα Τ + ΜΗC μόρια Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΑ 5 / 15- 10 -2012 Ι.Κ.ΑΓΓΕΛΗ ΑΝΟΣΟΛΟΓΙΚΕΣ ΤΕΧΝΙΚΕΣ ΑΝΤΙΓΟΝΑ: αναγνώριση από υποδοχέα Β ή από υποδοχέα Τ + ΜΗC μόρια Β-κύτταρο + αντιγόνο Τ-κύτταρο + αντιγόνο Εκτελεστικό Β-κύτταρο Β-κύτταρο μνήμης Εκτελεστικό Τ-κύτταρο Τ-κύτταρο μνήμης πλασματοκύτταρο CTL, Th, κλπ (εκκρίνουν κυτταροκίνες & κυτταροτοξικούς παράγοντες) (εκκρίνει αντισώματα)

2 Είδη επιτόπων:  πολλαπλοί επίτοποι στο ίδιο αντιγόνο  ανοσοεπικρατούντες ή κυρίαρχοι  μη αλληλοεπικαλυπτόμενοι  αλληλοεπικαλυπτόμενοι  γραμμικοί ή συνεχείς  διαμορφωτικοί  κρυπτικοί  15-22 αμινοξέα του ag συνδέονται με το ab  σύνδεση με δεσμούς Η +, ιοντικές και υδρόφοβες αλληλεπιδράσεις, van der Walls Αλληλεπίδραση αντισώματος-αντιγόνου αντιγόνο μτβλ περιοχή ελαφριάς αλυσίδας μτβλ περιοχή βαριάς αλυσίδας

3 Αντιδράσεις καθίζησης (κατακρήμνισης) σε υγρό μέσο σε πήκτωμα Αντιδράσεις συγκόλλησης (σχηματισμός κροκίδων) άμεση έμμεση ή παθητική ανασταλτική Αντιδράσεις με τη χρησιμοποίηση επισημασμένου αντιγόνου ή αντισώματος RIA ELISA-ELISPOT Western blotting Ανοσοφθορισμός-Κυτταρομετρία ροής Αντιδράσεις του συμπληρώματος Μέθοδοι προσδιορισμού των HLA αντιγόνων ΤΥΠΟΙ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

4 μονοκλωνικά, πολυκλωνικά αντισώματα ανασυνδυασμένα πεπτίδια Ag, Ab, συνδυασμένα Ag/Ab Ευχρηστία Αυτοματισμό αυξημένη ευαισθησία αυξημένη ειδικότητα αυξημένη αξιοπιστία σε όλα τα επίπεδα Η ανάπτυξη και η αναβάθμιση του υλικο-τεχνικού εξοπλισμού: - Μηχανικές, ηλεκτρονικές, μεγάλης ακρίβειας αναλώσιμου ρύγχους, (πολυκάναλες ή μη) πιπέτες - Ανοικτά ανοσολογικά συστήματα (robotic pippeting, washer, reader) - Αυτόματα ανοσολογικά συστήματα (combining incubation, washing and reading) Πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα Μεγάλος αριθμός δειγμάτων Ασφάλεια και Ακρίβεια Επαναληψιμότητα και αξιοπιστία Εκτυπώσιμα αποτελέσματα Επεξεργασία αποτελεσμάτων Ηλεκτρονική μεταφορά δεδομένων ΜΕΘΟΔΟΛΟΓΙΑ

5 ΔοκιμασίαΕυαισθησία (μg Ab/ml) Κατακρήμνιση σε διάλυμα20-200 Κατακρήμνιση σε πήκτωμα Μancini Ouchterlony 10-50 20-200 Ανοσοηλεκτροφόρηση Rocket ηλεκτροφόρηση 20-200 2 Αντιδράσεις συγκόλλησης Άμεση Παθητική Ανασταλτική 0.3 0.006-0.06 RIA0.0006-0.006 ELISA ELISA με χημειοφωταύγεια ~0.0001-0.01 ~0.00001-0.01 Ανοσοφθορισμός1 Κυτταρομετρία ροής0.006-0.06 ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΑΝΟΣΟΑΝΤΙΔΡΑΣΕΩΝ

6 ΤΥΠΟΙ ΑΝTIΔΡΑΣΕΩΝ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗΣ σε υγρό μέσο σε πήκτωμα απλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς μία κατεύθυνση) διπλή ανοσοδιάχυση (προς δύο κατευθύνσεις-Ouchterlony) κυκλοτερής ή ακτινωτή ανοσοδιάχυση (Mancini) ανοσοηλεκτροφόρηση-ηλεκτροφόρηση rocket

7 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ ΣΧΗΜΑΤΙΣΜΟΣ ΙΖΗΜΑΤΟΣ-ΖΩΝΗ ΙΣΟΔΥΝΑΜΙΑΣ Mancini Ouchterlony

8 ΑΝΟΣΟΔΙΑΧΥΣΗ ΣΕ ΠΗΚΤΩΜΑ Mancini Ouchterlony σχμ δακτυλίου σχμ τόξων κατακρήμνισης

9 ΑΝΟΣΟΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ διαχωρισμός αντιγόνων, αντιορός στην αύλακα, διάχυση κ’ κατακρήμνιση Μονοκλωνικές ανοσοσφαιρίνες αποτελούνται από βαριές και/ ή ελαφρές αλυσίδες ( 5 κατηγορίες βαριών: γ στην IgG, α στην IgA, μ στη IgM, δ στη IgD και ε στην IgΕ). Ελαφριές αλυσίδες  κ & λ. Ανοσοηλεκτροφόρηση = ποιοτική μέθοδος [συνδυασμός ηλεκτροφόρησης και ανοσοδιάχυσης] = πρωτεΐνες διαχωρίζονται ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης, ακολουθεί ταυτοποίηση μέσω ανοσοκατακρήμνισης με αντιορούς (ταυτοποίηση μονοκλωνικής πρωτεΐνης και καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων) Μονοκλωνικές ελαφριές αλυσίδες - νεφρική ανεπάρκεια, εναπόθεση ινιδίων αμυλοειδούς κ καταστροφή στα εγγύς σωληνάρια ή στο σπείραμα  ιζηματική νόσο ελαφρών αλυσίδων. Το 90% των ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα εμφανίζουν μονοκλωνική πρωτεΐνη στον ορό ή στα ούρα κατά τη διάγνωση. Τμήματα βαριών αλυσίδων καθώς και ελεύθερες ελαφριές αλυσίδες παρατηρούνται στα ούρα ασθενών με πολλαπλούν μυέλωμα ή αμυλοείδωση. Οι ανοσοσφαιρίνες IgD και IgΕ δε μπορούν να ανιχνευθούν γιατί βρίσκονται σε χαμηλές συγκεντρώσεις και δε σχηματίζουν ίζημα.

10 κωνοειδής ηλεκτροφόρηση: ποσοτικός προσδιορισμός αντιγόνων (κώνοι κατακρήμνισης) pH  ab ακίνητο + ag φορτίζεται (-) Κωνοειδείς κατακρημνίσεις με ύψος ~ [ag] {ab >>>> ισοηλ. σημείο /// αλκαλικό pH ab-ουδέτερο vs. αg (-) } ROCKET ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ

11 Ανοσοκαθήλωση = ποιοτική μέθοδος (50 φορές πιο ευαίσθητη vs ανοσοηλεκτροφόρηση). Διαχωρισμός πρωτεϊνών ~ φορτίο σε γέλη αγαρόζης & ταυτοποίηση ανοσοκαθήλωσης χρησιμοποιώντας ειδικούς μονοδύναμους αντιορούς  επιτυγχάνεται η ταυτοποίηση της μονοκλωνικής πρωτεΐνης και ο καθορισμός του τύπου των ελαφριών και βαριών αλυσίδων. Η μέθοδος αυτή ενδείκνυται ιδιαίτερα σε περιπτώσεις που πρέπει να ανιχνευθούν εξαιρετικά χαμηλές συγκεντρώσεις ανοσοσφαιρινών όπως για παράδειγμα σε μυέλωμα Bence Jones τύπου IgD και IgE, σε αμυλοείδωση, μονήρες πλασμοκύττωμα καθώς και στη διάγνωση υποτροπών μετά από μεταμόσχευση μυελού των οστών. Η ανοσοκαθήλωση είναι ταχύτερη, πιο ευαίσθητη και ευκολότερη στην ερμηνεία από την ανοσοηλεκτροφόρηση. Αντιθέτως, η ανοσοηλεκτροφόρηση είναι ευκολότερη από τεχνικής άποψης και λιγότερο δαπανηρή από την ανοσοκαθήλωση. Η υψηλή αναλυτική ευαισθησία της ανοσοκαθήλωσης έχει ως αποτέλεσμα να ανιχνεύεται υψηλότερο ποσοστό κλινικά ασχέτων ευρημάτων τα οποία μπορεί να οδηγήσουν σε επιπλέον διαγνωστική διερεύνηση. Ανοσοκαθήλωση ορού ασθενούς με μυέλωμα τύπου IgM λ ΑΝΟΣΟΚΑΘΗΛΩΣΗ

12 Μακροσφαιριναιμία Waldenstrom Κλινική Χρησιμότητα Ανίχνευση δικλωνικής γαμμοπάθειας Επιτρέπει τη διαφορική διάγνωση μεταξύ μονοκλωνικής, δικλωνικής και ολιγοκλωνικής γαμμοπάθειας Επιτρέπει την ανίχνευση ανοσοσφαιρινών που βρίσκονται σε πολύ χαμηλές συγκεντρώσεις στον ορό Μεταβολές Πολλαπλούν μυέλωμα Μακροσφαιριναιμία του Waldenström Αμυλοείδωση Λεμφοϋπερπλαστικές νόσοι

13 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ (σχμ κροκίδων) ΑΝΤΙΣΩΜΑ ΜΕ ΜΕΓΑΛΥΤΕΡΗ ΙΣΧΥ ΣΥΝΔΕΣΗΣ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΙΣ ΑΠΩΘΗΤΙΚΕΣ ΔΥΝΑΜΕΙΣ ΜΕΤΑΞΥ ΤΩΝ ΣΩΜΑΤΙΔΙΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ ΚΑΤΑΛΛΗΛΗ ΑΝΑΛΟΓΙΑ ΑΝΤΙΓΟΝΟΥ-ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ ΠΑΡΟΥΣΙΑ ΗΛΕΚΤΡΟΛΥΤΗ Τύποι αντιδράσεων άμεση συγκόλληση (πχ. ομάδες αίματος) έμμεση ή παθητική συγκόλληση (για διαλυτά Αg, με σωματίδια latex, πχ. μέθοδος Coombs) ανασταλτική συγκόλληση (πχ. test εγκυμοσύνης, ένδειξη/ανίχνευση χρήσης απαγορευμένων ουσιών [κοκαΐνης, ηρωίνης])

14 COOMBS COOMBS Π.χ. αιμολυτική αναιμία Π.χ. μεταγγίσεις

15 ανίχνευση ερυθροποιητίνης [ολυμπιάδα 2004] ΑΝΑΣΤΟΛΗ ΣΥΓΚΟΛΛΗΣΗΣ

16 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΜΕ ΧΡΗΣΗ ΕΠΙΣΗΜΑΣΜΕΝΩΝ ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ Η΄ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΩΝ Η επισήμανση γίνεται με μόρια που επιτρέπουν την εύκολη ανίχνευση και μέτρησή τους [RIA, ELISA – ELISPOT, ανοσοστύπωμα Western, ανoσοφθορισμός – κυτταρομετρία ροής ] ΜΕΘΟΔΟΣ RIA (radioimmunoassay) 1950: Rosalyn Yalow, Solomon Aaron Berson (Bronx Veterans Administration Hospital / Mount Sinai School of Medicine) 1977 Rosalyn ! Nobel Prize Ιατρικής (RIA ινσουλίνης)Rosalyn YalowSolomon Aaron BersonMount Sinai School of Medicine Γνωστή ποσότητα αντιγόνου καθίσταται ραδιενεργή (ιώδιο σε κατάλοιπα τυροσίνης) Ακολουθεί ανάμιξη με κατάλληλο αντίσωμα  σύμπλοκο Προστίθεται δείγμα ορού (κρύο αντιγόνο) και αντικαθιστά το ραδιενεργό Μέτρηση ελεύθερου αντιγόνου στο υπερκείμενο ΑΞΙΟΣΗΜΕΙΩΤΗ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑ ΥΨΗΛΗ ΕΙΔΙΚΟΤΗΤΑ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΜΟΣ ΑΝΑΛΥΤΗ ΜΕ ΤΟ ΡΑΔΙΕΝΕΡΓΑ ΣΗΜΑΣΜΕΝΟ ΑΝΤΑΓΩΝΙΣΤΗ ΤΟΥ ΓΙΑ ΠΕΡΙΟΡΙΣΜΕΝΟ ΠΟΣΟ ΑΝΤΙΣΩΜΑΤΟΣ

17 ELISA ( ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) με αντίσωμα

18 ELISPOT ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN Πήκτωμα επιστοίβαξης (ακρυλαμίδη) pH 6.8 συγκέντρωση των πρωτεϊνών σε μια γραμμή εκκίνησης Πήκτωμα διαχωρισμού pH 8.8 διαχωρισμός πρωτεϊνών ανάλογα με το ΜΒ τους και τη δομή τους SDS-PAGE ανίχνευση ενεργοποιημένων κυττάρων (ανσ-θεραπείας π.χ. αντικαρκινικό εμβόλιο  προσδιορισμός βελτιωμένης αντιγονοπαρουσίασης-έκκρισης ιντφν-γ) αναγωγή στο σύνολο των κυττάρων που εξετάστηκαν

19 Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο Επώαση με το δεύτερο αντίσωμα (συζευγμένο) HRP H 2 O 2 + DAB/luminol + Ανίχνευση της πρωτεΐνης Φίλτρο νιτροκυτταρίνης όπου έχουν μεταφερθεί οι πρωτεΐνες Επώαση με το πρώτο αντίσωμα και δέσμευσή του με το αντιγόνο ΑΝΟΣΟΣΤΥΠΩΜΑ WESTERN

20 ΑΝΟΣΟΦΘΟΡΙΣΜΟΣ

21 ΚΥΤΤΑΡΟΜΕΤΡΙΑ ΡΟΗΣ εναιώρημα ζωντανών κυττάρων + φθορισμο-ενεργοποιούμενος διαλογέας κυττάρων (FACS)  μέτρηση έντασης φθορισμού & διαχωρισμός κυτταρικών πληθυσμών ~ επιφανειακά αντιγόνα

22 ΠΡΩΤΕΟΜΙΚΗ ΑΝΑΛΥΣΗ 1. ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ~ ΦΟΡΤΙΟ [ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΗ ΕΣΤΙΑΣΗ] 2.ΔΙΑΧΩΡΙΣΜΟΣ ~ ΜΟΡΙΑΚΗ ΜΑΖΑ ΠΕΔΙΟ ΥΨΗΛΗΣ ΤΑΣΗΣ  ΜΕΤΑΚΙΝΗΣΗ ΠΡΩΤΕΪΝΩΝ ΣΕ ΣΤΑΘΕΡΗΣ ΚΛΙΣΗΣ pH ΚΑΙ ΕΝΤΟΠΙΣΜΟΣ ΣΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥΣ ΣΗΜΕΙΟ

23 ΑΝΤΙΔΡΑΣΕΙΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΟΣ Προϋποθέσεις: ανιχνεύει Ab στον ορό το σύμπλεγμα Ag-Ab που καταναλώνει το συμπλήρωμα δεν είναι ορατό χρειάζεται δείκτης = αιμολυτικό σύστημα ΠΡΟΣΟΧΗ: θετική είναι η αντίδραση που δε δίνει αιμόλυση Αιμολυτικό σύστημα = ερυθρά αιμοσφαίρια προβάτου (Ag) και ορός ζώου που περιέχει Ab έναντι των ερυθρών αιμοσφαιρίων του προβάτου

24 ΑΙΜΟΛΥΤΙΚΟ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑ

25 Προϋποθέσεις: Τ λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης Ι) και Β λεμφοκύτταρα (τυποποίηση για τα τάξης ΙΙ) πολυκλωνικοί ή μονοκλωνικοί αντι-HLA αντιοροί Μέθοδοι που χρησιμοποιούνται: μικρολεμφοκυτταρική δοκιμασία (ορολογική τυποποίηση) μοριακές μέθοδοι (PCR) μικτή λεμφοκυτταρική αντίδραση (MLR) ΠΡΟΣΔΙΟΡΙΣΜΟΣ HLA ΑΝΤΙΓΟΝΩΝ