Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης Λ. Ζέρβα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Αττικό Νοσοκομείο Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών.

Παρουσίαση με θέμα: "Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης Λ. Ζέρβα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Αττικό Νοσοκομείο Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης Λ. Ζέρβα Αναπληρώτρια Καθηγήτρια Εργαστήριο Κλινικής Μικροβιολογίας, Αττικό Νοσοκομείο Ιατρική Σχολή Πανεπιστημίου Αθηνών

2 Οικογένεια: Mycobacteriaceae Γένος: Mycobacteria Κύρια Χαρακτηριστικά Γένους Βακτηρίδια (Βάκιλλοι) Βακτηρίδια (Βάκιλλοι) Ιδιαίτερη δομή κυτταρικού τοιχώματος (  λιπιδίων) Ιδιαίτερη δομή κυτταρικού τοιχώματος (  λιπιδίων) Δεν αναπτύσσονται σε κοινά καλλιεργητικά υλικά Δεν αναπτύσσονται σε κοινά καλλιεργητικά υλικά Βραδύς χρόνος πολλαπλασιασμού Βραδύς χρόνος πολλαπλασιασμού Παρουσιάζουν και ενδοκυττάρια ανάπτυξη (μακροφάγα) Παρουσιάζουν και ενδοκυττάρια ανάπτυξη (μακροφάγα) Παθογονικότητα ποικίλει : Παθογονικότητα ποικίλει : αυστηρά παθογόνα ( M. tuberculosis)  σαπρόφυτα (M. gordonae) αυστηρά παθογόνα ( M. tuberculosis)  σαπρόφυτα (M. gordonae)

3 Γένος: Mycobacteria (1) Mycobacterium tuberculosis – complex M. tuberculosis M. tuberculosis M. bovis ( M. bovis BCG) M. bovis ( M. bovis BCG) M. africanum M. africanum M. canettii M. canettii M. caprae M. caprae M. microti M. microti M. pinnipedii M. pinnipedii Είδη → 99.9% ομοιότητα νουκλεοτιδίων, ίδια αλληλουχία 16S rRNA Είδη → 99.9% ομοιότητα νουκλεοτιδίων, ίδια αλληλουχία 16S rRNA Διαφορές: ξενιστής, παθογονικότητα, φαινοτυπικά χαρακτηριστικά Διαφορές: ξενιστής, παθογονικότητα, φαινοτυπικά χαρακτηριστικά (2) Mycobacterium leprae (3) Ατυπα Μυκοβακτηρίδια περισσότερα από 180 περισσότερα από 180 ↓↓ ικανότητα πρόκλησης νόσου στον άνθρωπο ↓↓ ικανότητα πρόκλησης νόσου στον άνθρωπο

4 Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης (ΜβΦ) Ιπποκράτης (400 πΧ) όρος: “φθίση” όρος: “φθίση” περιγραφή νόσου: βήχας + πυρετός + ιδρώτες + αιμόπτυση περιγραφή νόσου: βήχας + πυρετός + ιδρώτες + αιμόπτυση θεραπεία: υγειονοδιαιτητική αγωγή και κλιματοθεραπεία θεραπεία: υγειονοδιαιτητική αγωγή και κλιματοθεραπεία Robert Koch (1882) απομόνωση του ΜβΦ σε καλλιέργεια απομόνωση του ΜβΦ σε καλλιέργεια Παγκόσμια Οργάνωση Υγείας: 2009 9.4 εκατομμύρια νέων περιστατικών Φυματίωσης 9.4 εκατομμύρια νέων περιστατικών Φυματίωσης 1.7 εκατομμύρια θάνατοι από Φυματίωση (4.700 θάνατοι / ημέρα) 1.7 εκατομμύρια θάνατοι από Φυματίωση (4.700 θάνατοι / ημέρα)

5 Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης (ΜβΦ) ΜΙΚΡΟΒΙΟΛΟΓΙΑ αερόβιο, μη σπορογόνο, ακίνητο (μήκος 1-10 μm, πλάτος 0.2 μm) αερόβιο, μη σπορογόνο, ακίνητο (μήκος 1-10 μm, πλάτος 0.2 μm) κυττ. τοίχωμα:  περιεκτικότητα λιπιδίων (μυκολικά οξέα) κυττ. τοίχωμα:  περιεκτικότητα λιπιδίων (μυκολικά οξέα) Gram χρώση : δεν χρωματίζεται (Gram “μηδέν”) Gram χρώση : δεν χρωματίζεται (Gram “μηδέν”) οξεάντοχη χρώση θετική (λεπτό, κεκαμμένο βακτηρίδιο) οξεάντοχη χρώση θετική (λεπτό, κεκαμμένο βακτηρίδιο) ανάπτυξη όχι σε κοινά, αλλά μόνο σε ειδικά θρεπτικά υλικά ανάπτυξη όχι σε κοινά, αλλά μόνο σε ειδικά θρεπτικά υλικά χρόνος διπλασιασμού: 15-20 ώρες (  αργή ανάπτυξη in vitro) χρόνος διπλασιασμού: 15-20 ώρες (  αργή ανάπτυξη in vitro) βέλτιστη Τ ανάπτυξης 37 0 C, ατμόσφαιρα 5-10% CO 2 βέλτιστη Τ ανάπτυξης 37 0 C, ατμόσφαιρα 5-10% CO 2 αποικίες με «σχοινοειδή» ανάπτυξη αποικίες με «σχοινοειδή» ανάπτυξη ανάγει νιτρικά, παράγει νιασίνη ανάγει νιτρικά, παράγει νιασίνη φυσικός ξενιστής : άνθρωπος φυσικός ξενιστής : άνθρωπος

6 Κυτταρικό τοίχωμα του Mycobacterium tuberculosis

7 Μυκοβακτηρίδιο της Φυματίωσης (ΜβΦ) ΕΠΙΔΗΜΙΟΛΟΓΙΑ το ΜβΦ έχει “μολύνει”το 1/3 του πληθυσμού της γης το ΜβΦ έχει “μολύνει”το 1/3 του πληθυσμού της γης 10% των «μολύνσεων» (λοιμώξεων)  εξελίσσεται σε ενεργό νόσο 10% των «μολύνσεων» (λοιμώξεων)  εξελίσσεται σε ενεργό νόσο Από το 1985:  παρατηρείται παγκόσμια αύξηση της Φυματίωσης  εμφάνιση και εξάπλωση ανθεκτικών και πολυανθεκτικών στελεχών ΑΙΤΙΑ Αύξηση αριθμού άστεγων των πόλεων Αύξηση αριθμού άστεγων των πόλεων Αύξηση αριθμού χρηστών IV ναρκωτικών ουσιών Αύξηση αριθμού χρηστών IV ναρκωτικών ουσιών Επιδημία του AIDS Επιδημία του AIDS Παραμέληση κρατικών Προγραμμάτων Ελέγχου Φυματίωσης Παραμέληση κρατικών Προγραμμάτων Ελέγχου Φυματίωσης Αύξηση μετανάστευσης από χώρες με υψηλή συχνότητα νόσου Αύξηση μετανάστευσης από χώρες με υψηλή συχνότητα νόσου

8 MΕΤΑΔΟΣΗ εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων (βήχας, φτάρνισμα, ομιλία) εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων (βήχας, φτάρνισμα, ομιλία) σήμερα πιά σπάνια : M. bovis απο μολυσμένο γάλα (μη παστερίωση γάλατος) σήμερα πιά σπάνια : M. bovis απο μολυσμένο γάλα (μη παστερίωση γάλατος) Κίνδυνος λοίμωξης εξαρτάται:  πόσο στενή είναι η επαφή ? πόσο μεταδοτική είναι η πηγή ? Κίνδυνος μετάβασης από λοίμωξη σε ενεργό νόσο εξαρτάται:  πόσο μεγάλο ήταν το ΜβΦ. φορτίο ? εποχή “ανθεκτικότητας” σε νόσο ? παθογονικότητα στελέχους ?  1ος χρόνος: 3-4 %, μεταγενέστερα: 5-15% Αυξημένος Κίνδυνος “επικίνδυνες” ηλικίες [βρεφική, παιδική, 15-25 χρόνων, >65 χρόνων] “επικίνδυνες” ηλικίες [βρεφική, παιδική, 15-25 χρόνων, >65 χρόνων] ανοσοκαταστολή ανοσοκαταστολή

9 ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ (1) ΠΡΩΤΟΠΑΘΗΣ ΛΟΙΜΩΞΗ (κλινικά σιωπηρή) εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων εισπνοή μολυσμένων σταγονιδίων άφιξη ΜβΦ σε τελικούς αεραγωγούς άφιξη ΜβΦ σε τελικούς αεραγωγούς [ εντόπιση: μέσα πνευμονικά πεδία ] [ εντόπιση: μέσα πνευμονικά πεδία ] πολλαπλασιασμός σε κυψελίδες και μακροφάγα πολλαπλασιασμός σε κυψελίδες και μακροφάγα μετανάστευση μακροφάγων και λεμφοκυττάρων μετανάστευση μακροφάγων και λεμφοκυττάρων καμία βελτίωση καμία βελτίωση μολυσμένα μακροφάγα  επιχώριους λεμφαδένες μολυσμένα μακροφάγα  επιχώριους λεμφαδένες  κυκλοφορία αίματος  διασπορά στους ιστούς  κυκλοφορία αίματος  διασπορά στους ιστούς [ προτιμήσεις πχ κορυφές πνευμόνων, νεφροί ] [ προτιμήσεις πχ κορυφές πνευμόνων, νεφροί ]

10 Σε 3-8 εβδομάδες ανάπτυξη κυτταρικής ανοσίας και ιστικής υπερευαισθησίας [ θετική αντίδραση Mantoux ] Σε 3-8 εβδομάδες ανάπτυξη κυτταρικής ανοσίας και ιστικής υπερευαισθησίας [ θετική αντίδραση Mantoux ] διακοπή εξελικτικής πορείας βλάβης («περιχαράκωση») διακοπή εξελικτικής πορείας βλάβης («περιχαράκωση») ανάπτυξη κοκκιωματώδους φλεγμονής  «ίαση» ανάπτυξη κοκκιωματώδους φλεγμονής  «ίαση» σιωπηρή λοίμωξη σιωπηρή λοίμωξη [ Εξαίρεση σε παιδιά: Προϊούσα Πρωτοπαθής Λοίμωξη] [ Εξαίρεση σε παιδιά: Προϊούσα Πρωτοπαθής Λοίμωξη] (2) ΟΨΙΜΗ ΕΝΕΡΓΟΠΟΙΗΣΗ (κλινική νόσος) Μετά από λανθάνουσα περίοδο: πτώση άμυνας πτώση άμυνας ενεργοποίηση λοίμωξης  συμπτωματολογία (Φυματίωση) ενεργοποίηση λοίμωξης  συμπτωματολογία (Φυματίωση)

11 ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ M. tuberculosis → προσβολή οποιουδήποτε οργάνου M. tuberculosis → προσβολή οποιουδήποτε οργάνου Συχνότερα: προσβολή πνεύμονα (85%) Συχνότερα: προσβολή πνεύμονα (85%) Παθολογοανατομικό χαρακτηριστικό → κοκκίωμα Παθολογοανατομικό χαρακτηριστικό → κοκκίωμα η διάγνωση τίθεται με απομόνωση σε καλλιέργεια η διάγνωση τίθεται με απομόνωση σε καλλιέργεια

12 ΕΞΩΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ 15% των κλινικών εκδηλώσεων της Φυματίωσης ΠΑΘΟΓΕΝΕΣΗ πρωτοπαθής λοίμωξη  αιματογενής/λεμφογενής διασπορά  τοπικός πολλαπλασιασμός  έλεγχος από το ανοσοποιητικό πτώση άμυνας  ανάπτυξη νόσου Σημαντικότερες μορφές Κεχροειδής Φυματίωση (διάσπαρτη νόσος,  θνητότητα) Κεχροειδής Φυματίωση (διάσπαρτη νόσος,  θνητότητα) Φυματίωση του ΚΝΣ (  θνητότητα) Φυματίωση του ΚΝΣ (  θνητότητα) Αλλες εντοπίσεις : υπεζωκότας, σκελετικό (νόσος του Pott), γαστρεντερικό, ουρογεννητικό, περικάρδιο Αλλες εντοπίσεις : υπεζωκότας, σκελετικό (νόσος του Pott), γαστρεντερικό, ουρογεννητικό, περικάρδιο Λεμφαδενίτιδα (scrofula) : η συχνότερη Λεμφαδενίτιδα (scrofula) : η συχνότερη ΔΙΑΓΝΩΣΗ → δυσκολότερη

13 ΚΛΙΝΙΚΕΣ ΕΚΔΗΛΩΣΕΙΣ ΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ μη ειδική συμπτωματολογία μη ειδική συμπτωματολογία κακουχία, εξάντληση, απώλεια βάρους κακουχία, εξάντληση, απώλεια βάρους πυρετός, βήχας πυρετός, βήχας νυχτερινοί ιδρώτες νυχτερινοί ιδρώτες ΕΞΩΠΝΕΥΜΟΝΙΚΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗ μη ειδικές κλινικές εκδηλώσεις μη ειδικές κλινικές εκδηλώσεις ανάλογα με το όργανο που προσβάλεται ανάλογα με το όργανο που προσβάλεται

14 Εκτεταμένη πνευμονική φυματίωση (άμφω) Κεχροειδής φυματίωση

15 Δοκιμασία Φυματίνης (Mantoux, PPD test) Εξέταση ελέγχου επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας στα αντιγόνα του ΜβΦ Εξέταση ελέγχου επιβραδυνόμενης υπερευαισθησίας στα αντιγόνα του ΜβΦΕΡΩΤΗΜΑ «Εχει δεί» ποτέ το ανοσολογικό σύστημα το ΜβΦ ?? «Εχει δεί» ποτέ το ανοσολογικό σύστημα το ΜβΦ ?? Δηλαδή, έχει μολυνθεί ο ξενιστής από το ΜβΦ?? Δηλαδή, έχει μολυνθεί ο ξενιστής από το ΜβΦ?? Χορήγηση αντιγόνων του ΜβΦ στο άτομο Χορήγηση αντιγόνων του ΜβΦ στο άτομο Εάν το «εχει δεί»  θα το αναγνωρίσει  θα αντιδράσει  θετική αντίδραση Mantoux Εάν το «εχει δεί»  θα το αναγνωρίσει  θα αντιδράσει  θετική αντίδραση Mantoux Εάν «δεν το έχει δεί»  καμία αντίδραση  αρνητική αντίδραση Mantoux Εάν «δεν το έχει δεί»  καμία αντίδραση  αρνητική αντίδραση Mantoux

16 Δοκιμασία Φυματίνης

17 Δοκιμασία Φυματίνης (Mantoux, PPD test) ΔΙΑΔΙΚΑΣΙΑ Αντιγόνο: Purified Protein Derivative (PPD) Αντιγόνο: Purified Protein Derivative (PPD) (κεκαθαρμένο πρωτεϊνικό παράγωγο) (κεκαθαρμένο πρωτεϊνικό παράγωγο) 5 μονάδες Φυματίνης  ενδοδερμική ένεση 5 μονάδες Φυματίνης  ενδοδερμική ένεση ανάγνωση μετά 48-72 ώρες (αυστηρά καθορισμένα κριτήρια) ανάγνωση μετά 48-72 ώρες (αυστηρά καθορισμένα κριτήρια) θετική αντίδραση: διήθηση > 10 mm θετική αντίδραση: διήθηση > 10 mm προϋπόθεση: έλεγχος 3-4 εβδομάδες μετά την έκθεση προϋπόθεση: έλεγχος 3-4 εβδομάδες μετά την έκθεσηΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ Αρνητική αντίδραση Mantoux Αρνητική αντίδραση Mantoux  ο εξεταζόμενος δεν έχει έρθει ποτέ σε επαφή με το παθογόνο  ο εξεταζόμενος δεν έχει έρθει ποτέ σε επαφή με το παθογόνο Θετική αντίδραση Mantoux Θετική αντίδραση Mantoux  ο εξεταζόμενος έχει έρθει σε επαφή με το παθογόνο  ο εξεταζόμενος έχει έρθει σε επαφή με το παθογόνο

18 Δοκιμασία Φυματίνης

19 Δοκιμασία Φυματίνης (Mantoux, PPD test) ΜΕΙΟΝΕΚΤΗΜΑΤΑ Θετική Mantoux: δεν διαχωρίζεται η λοίμωξη στο παρελθόν από την ενεργό λοίμωξη (νόσο) Θετική Mantoux: δεν διαχωρίζεται η λοίμωξη στο παρελθόν από την ενεργό λοίμωξη (νόσο) σε ανοσοκαταστολή  ψευδώς αρνητική Mantoux σε ανοσοκαταστολή  ψευδώς αρνητική Mantoux ποσοστό έως 20% ασθενών με ενεργό Φυματίωση  ψευδώς αρνητική Mantoux (φαινόμενο ανοσολογικής ανεργίας) ποσοστό έως 20% ασθενών με ενεργό Φυματίωση  ψευδώς αρνητική Mantoux (φαινόμενο ανοσολογικής ανεργίας)ΣΥΜΒΟΛΗ διάγνωση Φ σε χώρες με χαμηλή συχνότητα νόσου διάγνωση Φ σε χώρες με χαμηλή συχνότητα νόσου καθορισμός χορήγησης προφυλακτικής αγωγής καθορισμός χορήγησης προφυλακτικής αγωγής

20 ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ κλινική εικόνα κλινική εικόνα ακτινολογικός έλεγχος ακτινολογικός έλεγχος αντίδραση Mantoux αντίδραση Mantoux ιστολογική εξέταση ιστολογική εξέταση εργαστηριακή διάγνωση εργαστηριακή διάγνωση Απαραίτητη → η Εγκαιρη Διάγνωση Απαραίτητη → η Εγκαιρη Διάγνωση Εναρξη αντιφυματικής αγωγής Εναρξη αντιφυματικής αγωγής Απομόνωση ασθενών Απομόνωση ασθενών Έλεγχος και χορήγηση προφύλαξης περιβάλλοντος Έλεγχος και χορήγηση προφύλαξης περιβάλλοντος

21 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ Λήψη κατάλληλου κλινικού δείγματος Λήψη κατάλληλου κλινικού δείγματος Παράδειγμα: 3 πρωινά δείγματα πτυέλων Παράδειγμα: 3 πρωινά δείγματα πτυέλων 3 δείγματα ούρων 3 δείγματα ούρων μεγάλος όγκος ΕΝΥ και άλλων υγρών μεγάλος όγκος ΕΝΥ και άλλων υγρών ειδική επεξεργασία του δείγματος ειδική επεξεργασία του δείγματος καταστροφή φυσιολογικής χλωρίδας, διαλυτοποίηση εκκρίσεων, συμπύκνωση καταστροφή φυσιολογικής χλωρίδας, διαλυτοποίηση εκκρίσεων, συμπύκνωση N-ακετυλο-κυστεΐνη, NaOH, 3.000xg σε ψυχόμενη φυγόκεντρο N-ακετυλο-κυστεΐνη, NaOH, 3.000xg σε ψυχόμενη φυγόκεντρο

22 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ (1) ΟΞΕΑΝΤΟΧΗ ΧΡΩΣΗ * Ziehl-Neelsen (Kinyoun, Auramine) 1ο βήμα: χρωματισμός με φουξίνη (κόκκινη) + θερμότητα 2ο βήμα: αποχρωματισμός με οξινισμένη αλκοόλη ΟΞΕΑΝΤΟΧΟ = ΔΕΝ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΖΕΤΑΙ ΟΞΕΑΝΤΟΧΟ = ΔΕΝ ΑΠΟΧΡΩΜΑΤΙΖΕΤΑΙ 3ο βήμα: αντίθετη χρώση με μπλέ του μεθυλενίου  ταχεία λήψη αποτελέσματος Προβλήματα

23 Προβλήματα Οξεάντοχης Χρώσης  Αναλυτική Ευαισθησία: 10 4 Μβ / ml πτυέλων  Διαγνωστική Ευαισθησία (?): 50-70% σε πνευμονική νόσο  Έλλειψη Ειδικότητας (αναγνώριση γένους, όχι είδους) [ M. tuberculosis ΠΑΘΟΓΟΝΟ  M. gordonae ΣΑΠΡΟΦΥΤΟ ] [ M. tuberculosis ΠΑΘΟΓΟΝΟ  M. gordonae ΣΑΠΡΟΦΥΤΟ ]  Η επεξεργασία δεν επιτρέπει την ταχεία λήψη αποτελεσμάτων  αποτέλεσμα σε 24 ώρες Δυνατότητα «άμεσης» Οξ.Χρώσης  Χωρίς επεξεργασία του δείγματος  αποτέλεσμα <1 ώρα  Ελάττωση Ευαισθησίας

24 Χρώση Ziehl-Neelsen: δείγμα πτυέλων

25 Αποικίες Mycobacterium tuberculosis

26 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ (2) ΚΑΛΛΙΕΡΓΕΙΑ ειδικά καλλιεργητικά υλικά: στερεά και υγρά ειδικά καλλιεργητικά υλικά: στερεά και υγρά παρατεταμένος χρόνος επώασης καλλιεργειών (4-6 εβδομάδες) παρατεταμένος χρόνος επώασης καλλιεργειών (4-6 εβδομάδες) ειδικοί χώροι υψηλής βιολογικής ασφάλειας (επικίνδυνο παθογόνο) ειδικοί χώροι υψηλής βιολογικής ασφάλειας (επικίνδυνο παθογόνο) Στερεά Υλικά: σωληνάρια Loewenstein-Jensen (L-J), Middlebrook Στερεά Υλικά: σωληνάρια Loewenstein-Jensen (L-J), Middlebrook  L-J: αυγά, πουρές πατάτας, γλυκερόλη, άλατα, πράσινο του Μαλαχίτη  Επώαση σε 37 0 C, σε ατμόσφαιρα 10% CO 2 Υγρά Υλικά: Ημι- εως και πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα : BACTEC 460 και 9000 MB, MGIT 960 (Becton Dickinson), ESP II System (Trek Systems), BacT/ALERT (Biomerieux), MB Redox (Biotest) Υγρά Υλικά: Ημι- εως και πλήρως αυτοματοποιημένα συστήματα : BACTEC 460 και 9000 MB, MGIT 960 (Becton Dickinson), ESP II System (Trek Systems), BacT/ALERT (Biomerieux), MB Redox (Biotest) Μέσος χρόνος ανίχνευσης (+) ΜβΦ καλλιεργειών : 9-14 ημέρες Μέσος χρόνος ανίχνευσης (+) ΜβΦ καλλιεργειών : 9-14 ημέρες  ποσοστού απομόνωσης Μυκοβακτηριδίων (σε σύγκριση με στερεά)  ποσοστού απομόνωσης Μυκοβακτηριδίων (σε σύγκριση με στερεά)

27 MGIT 960

28 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ (2α) ΣΥΜΒΑΤΙΚΗ ΦΑΙΝΟΤΥΠΙΚΗ ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ Βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης, χρόνος ανάπτυξης αποικιών, παραγωγή χρωστικής, μορφολογία αποικιών, βιοχημικές δοκιμασίες Βέλτιστη θερμοκρασία ανάπτυξης, χρόνος ανάπτυξης αποικιών, παραγωγή χρωστικής, μορφολογία αποικιών, βιοχημικές δοκιμασίες Παρατεταμένος χρόνος λήψης αποτελέσματος Παρατεταμένος χρόνος λήψης αποτελέσματος (2β) ΤΑΥΤΟΠΟΙΗΣΗ ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΕΣ ΜΕΘΟΔΟΥΣ υβριδισμός νουκλεïκών οξέων υβριδισμός νουκλεïκών οξέων PCR και υβριδισμός PCR και υβριδισμός (2γ) ΠΡΟΤΥΠΗ ΜΕΘΟΔΟΣ προσδιορισμός αλληλουχίας γονιδίων (16S rRNA, hsp65) ή PCR-RFLP (  ακρίβεια,  πληροφορίες,  ΧΛΑ,  κόστος) προσδιορισμός αλληλουχίας γονιδίων (16S rRNA, hsp65) ή PCR-RFLP (  ακρίβεια,  πληροφορίες,  ΧΛΑ,  κόστος)

29 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ (3) ΑΜΕΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ μέθοδοι πολλαπλασιασμού νουκλεïκών οξέων μέθοδοι πολλαπλασιασμού νουκλεïκών οξέων πρότυπο : αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πρότυπο : αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction, PCR) (Polymerase Chain Reaction, PCR)

30 ΑΜΕΣΗ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΣΤΟ ΚΛΙΝΙΚΟ ΔΕΙΓΜΑ Polymerase Chain Reaction, PCR Polymerase Chain Reaction, PCR  Ευαισθησία: εύρος 75-85% (σε δείγματα αναπνευστικού) - πάντα μικρότερη από αυτήν της καλλιέργειας - πάντα μικρότερη από αυτήν της καλλιέργειας - πάντα μεγαλύτερη σε δείγματα με (+) Οξ.Χρώση - πάντα μεγαλύτερη σε δείγματα με (+) Οξ.Χρώση  Ειδικότητα: > 95%  Παρέχει προκαταρκτικά αποτελέσματα  Μεγάλο κόστος (εφαρμογή μόνο σε επιλεγμένα δείγματα)  Ποτέ δεν παραλείπεται η καλλιέργεια - διότι θέτει την οριστική διάγνωση - διότι θέτει την οριστική διάγνωση - διότι απαιτείται για τη διενέργεια του ελέγχου αντοχής - διότι απαιτείται για τη διενέργεια του ελέγχου αντοχής - διότι καθιστα δυνατές επιδημιολογικές μελέτες - διότι καθιστα δυνατές επιδημιολογικές μελέτες

31 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ (ΤUBERCULOSIS, TB)  Τα περισσότερα Μβ ανθεκτικά σε “κοινά” αντιμικροβιακά Αντιφυματικά 1ης εκλογής (Πρωτεύοντα) Αντιφυματικά 1ης εκλογής (Πρωτεύοντα) Ισονιαζίδη (INH) Ισονιαζίδη (INH) Ριφαμπικίνη (RIF) Ριφαμπικίνη (RIF) Πυραζιναμίδη (PZΜ) Πυραζιναμίδη (PZΜ) Εθαμβουτόλη (EΜΒ) Εθαμβουτόλη (EΜΒ) Στρεπτομυκίνη (SM) Στρεπτομυκίνη (SM) Χορήγηση συνδυασμού Φαρμάκων (Φ) Χορήγηση συνδυασμού Φαρμάκων (Φ) Μακροχρόνια χορήγηση θεραπείας Μακροχρόνια χορήγηση θεραπείας

32 Σχήμα θεραπείας (πνευμονική ΤΒ χωρις σπήλαιο): 2 μήνες: INH + RIF + PZA και [SM ή ΕΜΒ] 2 μήνες: INH + RIF + PZA και [SM ή ΕΜΒ] 4 μήνες: INH + RIF 4 μήνες: INH + RIFΧΗΜΕΙΟΠΡΟΦΥΛΑΞΗ χορήγηση INH για 6-12 μήνες χορήγηση INH για 6-12 μήνες σε άτομα με  πιθανότητα έκθεσης (πχ πρόσφατη θετικοποίηση Mantoux) σε άτομα με  πιθανότητα έκθεσης (πχ πρόσφατη θετικοποίηση Mantoux)

33 Γιατί χορήγηση συνδυασμού θεραπείας ??  Εμφάνιση αυτόματων μεταλλάξεων → Ανάπτυξη Αντοχής Στελέχη RIF-R: Οι μεταλλάξεις εντοπίζονται σε περιοχή 81-bp του γονιδίου rpoB  > 95% όλων των RIF-R στελεχών Στελέχη INH-R: Οι μεταλλάξεις εντοπίζονται σε διάφορα γονίδια και περιοχές  50-95% μεταλλάξεις στο κωδικόνιο 315 του γονιδίου katG  20-35% μεταλλάξεις στην ρυθμιστική περιοχή του inhA  10-15% μεταλλάξεις στην ρυθμιστική περιοχή ahpC-oxyR (  katG μεταλλάξεις εκτός του κωδικόνιου 315) (  katG μεταλλάξεις εκτός του κωδικόνιου 315)

34 ΘΕΡΑΠΕΙΑ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ Φορτίο ΜβΦ σε σπήλαια: 10 9 κύτταρα Φορτίο ΜβΦ σε σπήλαια: 10 9 κύτταρα συχνότητα αντοχής σε INH : 10 -8 κύττ. συχνότητα αντοχής σε INH : 10 -8 κύττ. συχνότητα αντοχής σε SM : 10 -8 κύττ. συχνότητα αντοχής σε SM : 10 -8 κύττ. Επομένως → χορήγηση συνδυασμού φαρμάκων INH + SM = συχνότητα 10 -16 INH + SM = συχνότητα 10 -16 Στόχος Θεραπευτικού Σχήματος  Παρεμπόδιση πολλαπλασιασμού R-κυττάρων → χορηγώντας 3 τουλ. δραστικά Φ κατά την αρχική φάση

35 “ fall and rise phenomenon ” Σε χορήγηση Μονοθεραπείας: Αρχική Φάση: “επιτυχής” ελάττωση πληθυσμού Βακίλλων  θάνατος Ευαίσθητων-Βακίλλων → μείωση μικροβιακού φορτίου → κλινική βελτίωση, αρνητικοποίηση οξεάντοχης χρώσης  ωστόσο, οι μεταλλαγμένοι R-Βάκιλλοι επιβιώνουν Ακόλουθη Φάση: αντικατάσταση πληθυσμού Βακίλλων  πολλαπλασιασμός μεταλλαγμένων R-βακίλλων → αντικατάσταση πληθυσμού από R-κύτταρα  συνεχής πολλαπλασιασμός → κλινική συμπτωματολογία και θετικοποίηση οξεάντοχης χρώσης → Επίκτητη Αντοχή (Δευτερογενής Αντοχή)

36 ΣΕΝΑΡΙΟ: Ασθενής με λοίμωξη από R-στέλεχος (λόγω Επίκτητης Αντοχής) → μετάδοση στην κοινότητα ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ: Πρωτογενής Αντοχή → νέος ξενιστής μολύνεται από το R-στέλεχος → η αντοχή υπάρχει πριν την έναρξη της θεραπείας του Αντίθετα, η Δευτερογενής (Επίκτητη) Αντοχή Δημιουργείται λόγω ακατάλληλης ή ατελούς θεραπείας Δημιουργείται λόγω ακατάλληλης ή ατελούς θεραπείας Μη συμμόρφωση του ασθενούς Μη συμμόρφωση του ασθενούς Υποθεραπευτικά επίπεδα Υποθεραπευτικά επίπεδα Λανθασμένο σχήμα Λανθασμένο σχήμα Ποιότητα φαρμάκου Ποιότητα φαρμάκου

37 H Επίφοβη Ανθεκτικότητα Στελέχη MDR (MultiDrug Resistant)  Ταυτόχρονη R-σε ΙΝΗ και RIF (με ή χωρίς R σε άλλα Φάρμακα 1 ης εκλογής) Στελέχη XDR (Extensively Drug Resistant)  ΜDR  Επιπλέον R-σε οποιαδήποτε κινολόνη  Επιπλέον R-σε 1 τουλάχιστον από τα 3 δευτερεύοντα ενέσιμα (αμικασίνη, καναμυκίνη, καπρεομυκίνη)

38 ΕΡΓΑΣΤΗΡΙΑΚΗ ΔΙΑΓΝΩΣΗ ΕΛΕΓΧΟΣ ΕΥΑΙΣΘΗΣΙΑΣ ΣΕ ΑΝΤΙΦΥΜΑΤΙΚΑ σήμερα πιά απαραίτητος: εμφάνιση και εξάπλωση ανθεκτικών/πολυανθεκτικών στελεχών σήμερα πιά απαραίτητος: εμφάνιση και εξάπλωση ανθεκτικών/πολυανθεκτικών στελεχών διαφορετική μεθοδολογία από κοινά βακτήρια (κέντρα αναφοράς) διαφορετική μεθοδολογία από κοινά βακτήρια (κέντρα αναφοράς) ΧΩΡΙΣ ΘΕΡΑΠΕΙΑ: 50% ασθενών με πνευμονική φυματίωση  θάνατος μέσα σε 2 χρόνια 25% ασθενών με πνευμονική φυματίωση  ίαση

39 Έλεγχος Ευαισθησίας ΜΤΒ (A) Μέθοδος των Αναλογιών σε Αγαρ (πρότυπη μέθοδος)  Καλλιεργητική μέθοδος σε στερεό θρεπτικό υλικό  εάν περισσότερα από το 1% των κυττάρων ΜβΦ είναι ανθεκτικά στο αντιφυματικό που εξετάζεται in vitro  η θεραπεία δεν θα είναι αποτελεσματική  Αποτέλεσμα σε 3 εβδομάδες (B) Αυτοματοποιημένες Μέθοδοι σε Υγρό Θρεπτικό Υλικό ****  Καλλιεργητικές μέθοδοι σε υγρό θρεπτικό υλικό  BACTEC 460, MGIT 960, ESP II System (Trek Systems)  Ταχύτερα αποτελέσματα  8-10 ημέρες

40 Μέθοδος Αναλογιών σε Αγαρ αραίωση 1:100 αραίωση 1: 1.000

41 Έλεγχος Ευαισθησίας ΜΤΒ (Γ) Εμπορικές Μοριακές Μέθοδοι **** (PCR και υβριδισμός, αποτελέσματα σε 1 ημέρα) (PCR και υβριδισμός, αποτελέσματα σε 1 ημέρα) (1) Inno-Lipa Rif TB (Innogenetics) - ανίχνευση αντοχής σε RIF - ανίχνευση αντοχής σε RIF (2) Genotype MTBDRplus (Hain-Lifescience) - ανίχνευση αντοχής σε RIF και INH - ανίχνευση αντοχής σε RIF και INH

42 Genotype MTBDRplus

43

44 - Επαγρύπνηση -  3.6% όλων των Π-ΤΒ αποτελούν MDR-TB  440.000 περισταστικά MDR (390.000-510.000)  150.000 θάνατοι από MDR-TB  50% των Π-MDR-TB σε δύο χώρες: Κίνα και Ινδία Ιδιαιτερότητες:  Περιγράφονται 12 χώρες, όπου σε νέα-Π-ΤΒ: ≥ 6% MDR-TB  6/12 χώρες, σε προηγ.θερ-Π-ΤΒ: ≥ 50% MDR-TB  χώρες της Αν. Ευρώπης ή Κεντρ. Ασίας

45

46

47 - Ανταπόκριση -  WHO, 2009: «τα κράτη-μέλη χρειάζεται να επιτύγχουν καθολική πρόσβαση στη διάγνωση και θεραπεία της MDR/XDR-TB»  “27 χώρες” με υψηλή επιβάρυνση MDR-TB  τουλάχιστον 4.000 περιστατικά MDR-TB ετησίως και/η τουλάχιστον 10% των νέων περιστατικών με MDR-TB  Αrmenia, Azerbaijan, Bangladesh, Belarus, Bulgaria, China, Democratic Republic of Kongo, Estonia, Ethiopia, Georgia, India, Indonesia, Kazakhstan, Kyrgystan, Latvia, Lithuania, Myanmar, Nigeria, Pakistan, Philippines, Republic of Moldova, Russian Federation, South Africa, Tajikistan, Ukraine, Uzbekistan, Viet Nam.

48 ΕΜΒΟΛΙΟ ΦΥΜΑΤΙΩΣΗΣ: BCG Bacillus Calmette-Guerin ζωντανό, εξασθενημένο στέλεχος M. bovis ζωντανό, εξασθενημένο στέλεχος M. bovis ανεπαρκές, ως εμβόλιο ανεπαρκές, ως εμβόλιοΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΙΚΟΤΗΤΑ δεν εμποδίζει την λοίμωξη, αλλά (συνήθως) την σοβαρή (ή διάσπαρτη) νόσο σε μικρά παιδιά δεν εμποδίζει την λοίμωξη, αλλά (συνήθως) την σοβαρή (ή διάσπαρτη) νόσο σε μικρά παιδιά σε παιδιά:  συχνότητας Φ κατά 60-80% σε παιδιά:  συχνότητας Φ κατά 60-80% επομένως  δεν εξαλείφει την νόσο επομένως  δεν εξαλείφει την νόσο ΕΝΔΕΙΞΕΙΣ ΧΟΡΗΓΗΣΗΣ σε χώρες με υψηλή νοσηρότητα σε χώρες με υψηλή νοσηρότητα σε μικρά παιδιά (με αρνητική Mantoux) σε μικρά παιδιά (με αρνητική Mantoux) ΑΝΤΕΝΔΕΙΞΕΙΣ  ανοσοκαταστολή ΠΑΡΕΝΕΡΓΕΙΕΣ  ασφαλές