Μελέτη Πρωτεινών Τρούγκος Κ. Αν. Καθ. Βιοχημείας Εργ. Βιολογικής Χημείας Ιατρικής ΕΚΠΑ.

Παρουσίαση με θέμα: "Μελέτη Πρωτεινών Τρούγκος Κ. Αν. Καθ. Βιοχημείας Εργ. Βιολογικής Χημείας Ιατρικής ΕΚΠΑ."— Μεταγράφημα παρουσίασης:

1 Μελέτη Πρωτεινών Τρούγκος Κ. Αν. Καθ. Βιοχημείας Εργ. Βιολογικής Χημείας Ιατρικής ΕΚΠΑ

2 Διαχωρισμός κυτταρικών συστατικών Λύση και Ομογενοποίηση κυττάρων ΔΙΑΦΟΡΙΚΗ φυγοκέντρηση σε αυξανόμενες ταχύτητες

3

4 Διαχωρισμός με βάση S (πυκνότητα σωματιδίων/σχήμα κλπ ) Κλίση πυκνότητας πχ σουκρόζης

5

6

7 Τεχνικές χρωματογραφίας Χρωματογραφία Μοριακής διήθησης Στήλη έχει υλικό με σφαίρες που έχουν οπές. Μικρού μεγέθους πρωτείνη εισέρχεται εντός και καθυστερεί ενώ μεγάλες δεν εισέρχονται

8

9 Χρωματογραφία Ιοντοανταλλακτική Υλικό στήλης έχει φορτίο πχ αρνητικό και συγκρατεί πρωτείνες με αντίθετο φορτίο. Διαχωρίζονται οι θετικά φορτισμένες πρωτείνες. Αλλαγή pH διαλύτη, αλλάζει το φορτίο της δεσμευμένης πρωτείνης με αποτέλεσμα τη συλλογή της μετά την έκλουση των υπολοίπων.

10

11 Χρωματογραφία συγγένειας. Στη στήλη η ρητίνη έχει συγγένεια για μία από τις προς διαχωρισμό πρωτείνες πχ έχει αντίσωμα. Συγκρατά τη πρωτείνη που αναγνωρίζει το αντίσωμα (διαχωρισμός). Αλλαγή pH διαλύτη για « απελευθέρωση» και συλλογή της επιθυμητής πρωτείνης μετά την έκλουση των άλλων.

12

13

14

15 Ηλεκτροφόρηση σε πηκτή Διαχωρισμός πρωτεινών με βάση το Μοριακό Βάρος Μ. Β. Η κίνηση είναι αντιστρόφως ανάλογος του Μ.Β Προυπόθεση νάχουμε αποδιατάξει τη πρωτείνη και να έχουμε δώσει ομοιόμορφο φορτίο (αρνητικό) με SDS

16

17

18 Ισοηλεκτρική Εστίαση –IEF (Isoelectric Focusing) Διαχωρισμός με βάση το pI (ισοηλεκτρικό σημείο μίας πρωτείνης). Κάνουμε κλίση / βαθμίδωση pH Πρωτείνες υπό επίδραση ηλεκτρικού πεδίου κινούνται έως ότου συναντήσουν το pI τους όπου και ακινητοποιούνται. Ισοηλεκτρικό σημείο έιναι το pH εκείνο στο οποίο το συνολικό φορτίο μίας πρωτείνης είναι μηδέν.

19

20 Καθαρισμός πρωτείνης Με εφαρμογή διάφορων τεχνικών που βασίζονται στις Φυσικοχημικές ιδιότητες των πρωτεινών επιτυγχάνεται ο διαχωρισμός από το μίγμα και σταδιακά ο καθαρισμός μίας πρωτείνης ώστε στη συνέχεια να είναι εφικτή η μελέτη της.

21

22 Μελέτη πρωτοταγούς δομής μίας πρωτείνης Μέθοδος EDMAN Σήμανση στο αμινοτελικό άκρο (PTH) Ηπια υδρόλυση (με αραιό οξύ) όπου το πρώτο μόνο αμινοξύ αποσπάται ως κυκλικό παράγωγο και χαρακτηρίζεται. Επανάληψη διαδικασίας για 50 περίπου φορές. Αν πρωτείνη έχει πιο πολλά αμινοξέα τότε

23 Συνέχεια ΕDMAN Yδρόλυση πρωτείνης σε πεπτίδια με ειδικές πεπτιδάσες που κόβουν μετά από κάποιο συγκεκριμένο αμινοξύ. Διαχωρισμός πεπτιδίων και λήψη τους σε καθαρή μορφή (με χρωματογραφία ή ηλεκτροφόρηση) Εφαρμογή σε κάθε πεπτίδιο της τεχνικής ΕDMAN

24 ΕDMAN συνέχεια Η σειρά των πεπτιδίων επιτυγχάνεται με νέα ειδική υδρόλυση της αρχικής πρωτείνης με άλλη ειδική πεπτιδάση Διαχωρισμό πεπτιδίων Εφαρμογή σε κάθε πεπτίδιο της τεχνικής EDMAN Eύρεση σειράς μέσω επικαλυπτόμενων πεπτιδίων.

25

26

27 Σημασία εύρεσης πρωτοταγούς δομής πρωτείνης Μελέτη δομών / συγκριτικές μελέτες με πρωτείνες άλλων οργανισμών /εξέλιξη. Μελέτη DNA/ γονιδίου. Κατασκευή αντισωμάτων έναντι της πρωτείνης. Σύνθεση πρωτείνης για φάρμακο.

28

29 Σύνθεση πεπτιδίου στερεάς φάσης Αρχίζει από το καρβοξυτελικό άκρο. Γίνεται πάνω σε ρητίνη με διαδοχική προσθήκη αμινοξέων και πλύσιμο αυτής πρίν από κάθε νέα προσθήκη (καθαρισμός) Πρέπει να αντιδράσουν οι σωστές ομάδες πχ καρβοξυλομάδα (ν-1) αμινοξέος και αμινομάδα (ν) αμινοξέος. Για το λόγο αυτό οι πλάγιες ομάδες των αμινοξέων είναι προστατευμένες όπως και αμινομάδα του ν-1 αμινοξέος (t-boc) ενώ η καρβοξυλομάδα του ν αμινοξέος ενεργοποιημένη.

30

31

32 Χρήση συνθετικών πεπτιδίων Ως φάρμακα Δημιουργία αντισωμάτων Μελέτη δομών στο χώρο